鉴定桂花结实性的KASP分子标记引物组、试剂盒及其应用

本发明涉及桂花分子标记，具体而言，涉及鉴定桂花结实性的kasp分子标记引物组、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、桂花是中国的传统十大名花之一，在人工引种驯化的漫长过程中，通过种内变异的积累和与木犀属近缘种的杂交，形成了丰富的种内变异和品种资源。桂花具有典型的雄全异株性系统，即同时拥有雄性株和两性株。雄性桂花的雌蕊退化，结实很少或完全不结实，而两性桂花的雌蕊正常发育，子房膨大成圆球形或卵圆形，可结实(图1所示)。雌蕊发育情况和结实与否是桂花品种的稳定性状，在品种分类和产业应用上有重要价值。不结实品种在末花期花瓣连同花梗大量脱落，适合作为产花树，为桂花食品、香料、药品等产品的开发提供鲜花原料；正常结实的桂花品种花瓣脱落较少，在产业上通常被用于播种繁殖、杂交育种等。

2、因此，开发与桂花结实性状关联的分子标记，在幼苗期高通量鉴定品种的结实情况，能够为桂花品种分类和分子辅助育种提供有效的技术支持，在生产上具有重要的应用价值。

3、前期的桂花品种研究开发的分子标记大多是在非编码区扩增或是在基因组中随机扩增，获得的多态性位点通常与目标性状的遗传距离较远，限制了这些标记在重要性状基因定位、图位克隆以及分子标记辅助育种中的应用。新一代测序技术的广泛应用推动了标记技术的发展，使得单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)等第三代分子标记逐渐居于主流地位。snp标记具有密度大、变异来源丰富、与功能基因甚至植物表型关联度高等优点。kasp-snp标记是由kasp(kompetitive allele specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)技术转化后用于植物遗传育种的一种snp标记。kasp技术主要是通过终端荧光信号的读取判断目标位点的基因型，原理是依据引物末端碱基的特异性匹配，利用touch-down pcr与荧光淬灭探针结合，发出荧光信号来对snp分型及检测indels插入和缺失。由于kasp-snp标记具有高通量、低成本和高准确性的特点，逐步成为了分子标记辅助育种中常用的标记类型。

4、2018年，桂花染色体水平全基因组草图正式发布，这一成果为桂花特异性snp标记的大规模研发并应用于育种实践和新品种鉴定提供了重要平台。近年来，全基因组关联分析(genome-wide association study，gwas)陆续被应用于梅花、月季、荷花等观赏花卉中，成为发现复杂性状位点的重要分析方法。目前尚无利用gwas进行桂花结实性状研究的技术方案。

5、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种鉴定桂花结实性的kasp分子标记引物组、试剂盒及其应用以解决上述技术问题。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种snp位点在鉴定桂花结实性或桂花辅助育种中的应用，snp位点位于桂花3号染色体第6301644bp处，且多态性为g/a。

4、基于前期的种质资源调查，对全国桂花产区的种质资源进行整理，共收集到123份种质资源，进行了基因组重测序，并测定了其中92份种质资源的结实情况，将基因组数据与桂花结实性进行全基因组关联分析，在3号染色体的6301644bp位置检测到snp，多态性为g/a。

5、通过检测桂花品种该位置的基因分型，能够鉴定桂花的结实性状，可筛选在结实性上符合预期的种质材料。

6、在一种可选的实施方式中，snp位点位于桂花基因组prjna529305第3号染色体第6301644位碱基。

7、根据snp位置查找到基因的cds序列如seq id no.4所示。

8、在本发明应用较佳的实施方式中，snp的多态性位点位于seq id no.4所示的核苷酸序列第262bp处。

9、第二方面，本发明提供了一种鉴定桂花结实性的kasp分子标记引物组，其包括：如seq id no.1所示的正向引物1、如seq id no.2所示的正向引物2和如seq id no.3所示的反向引物。

10、seq id no.1所示的序列为：gcgagtatacatggatgccacg；

11、seq id no.2所示的序列为：gcgagtatacatggatgccaca；

12、seq id no.3所示的序列为：

13、cgttagtcttcataaccgaaaatacttaattg。

14、在本发明应用较佳的实施方式中，正向引物1的5’端还连接有激发荧光基团1或激发荧光标签序列1；正向引物2的5’端还连接有激发荧光基团2或激发荧光标签序列2；且激发荧光基团1和激发荧光基团2不同，激发荧光标签序列1与激发荧光标签序列2不同。

15、正向引物1或正向引物2的5’端连接激发荧光标签序列后，便于在第二轮pcr(也即第一轮降落pcr结束后的pcr过程)中反应体系中的带有荧光基团的探针结合扩增模板，此时原本互补的探针彼此分离，然后产生荧光信号，最终在低于40度情况下通过读取中终点的荧光信号来进行snp分型。

16、为了准确分型，设置激发荧光基团1和激发荧光基团2不同，激发荧光标签序列1与激发荧光标签序列2不同。本领域的技术人员可以根据检测的需要选择合适的激发荧光基团或激发荧光标签序列。

17、在本发明应用较佳的实施方式中，激发荧光基团1选自fam、hex、tet、vic、joe、cy3、cy3.5、ned、tamra、rox、texas red、cy5、cy5.5和quasar670中的任意一种，激发荧光基团2选自fam、hex、tet、vic、joe、cy3、cy3.5、ned、tamra、rox、texas red、cy5、cy5.5和quasar670中的任意一种。

18、在一种可选的实施方式中，激发荧光标签序列1选自fam、hex、tet、vic、joe、cy3、cy3.5、ned、tamra、rox、texas red、cy5、cy5.5和quasar670中的任意一种的荧光标签序列。

19、激发荧光标签序列2选自fam、hex、tet、vic、joe、cy3、cy3.5、ned、tamra、rox、texas red、cy5、cy5.5和quasar670中的任意一种的荧光标签序列。

20、在一种可选的实施方式中，激发荧光标签序列1的序列如seq id no.7所示，激发荧光标签序列2的序列如seq id no.8所示。

21、seq id no.7所示的序列为：gaaggtgaccaagttcatgct；seq id no.8所示的序列为：gaaggtcggagtcaacggatt。

22、在一种可选的实施方式中，根据正向引物1和正向引物2上连接的两种不同荧光的峰值大小，绘制聚类图，判定待测样品的基因型；若待测样品的基因型为g/g或g/a，则该桂花品种的雌蕊退化或完全败育，不结实；若该位点基因型为a/a，则该桂花品种雌蕊正常发育，可结实。

23、第三方面，本发明提供了一种鉴定桂花结实性的试剂或试剂盒，其包括上述的kasp分子标记引物组。

24、在一种可选的实施方式中，试剂或试剂盒还包括kasp反应预混液，kasp反应预混液包括参比荧光探针、参比淬灭探针、taq聚合酶、游离核苷酸和mg2+，参比荧光探针与参比淬灭探针互补，且参比荧光探针包括多种，其中一种参比荧光探针与激发荧光标签序列1一致，其中一种参比荧光探针与激发荧光标签序列2一致。

25、kasp反应预混液可采用市售的kasp master mix，如购自广州固德生物技术有限公司的kasp master mix。

26、试剂的形态包括不限于固体、液体或半固体。

27、第四方面，本发明还提供了kasp分子标记引物组在制备鉴定桂花结实性的试剂或试剂盒中的应用。

28、第五方面，本发明还提供了一种鉴定桂花结实性的方法，其包括如下步骤：

29、采用上述的kasp分子标记引物组或上述的试剂或试剂盒对待测样本的基因组dna进行pcr扩增，得到扩增产物；对扩增产物进行kasp基因分型检测，当kasp基因分型检测结果为aa型时，鉴定桂花结实性状为可结实；当kasp基因分型检测结果为ga或gg型时，鉴定桂花结实性状为98.7％不可结实。剩余的1.3％个别桂花品种snp位点的基因型为ga或gg，但实质为可结实品种。

30、在一种可选的实施方式中，根据kasp扩增产物荧光信号的差异，利用abiquantstudio 5机器进行荧光数据读取和分析，鉴别出待测桂花的基因型。

31、鉴别出的桂花基因型包括gg、aa和ga，其中gg和ga为不可结实的桂花，aa为可结实桂花。

32、当正向引物1的5’端标记有fam荧光信号标签，正向引物2的5’端带有hex荧光信号标签时，根据荧光颜色分类，得到基因分型效果图，从而进行桂花基因型的鉴别。总共可检测到三种基因型，分别是杂合型ga与纯合型gg、aa，其中杂合型ga为绿色(蓝色与红色荧光混合)，纯合型gg为蓝色，aa为红色。

33、由于正向引物1的5’端带有fam荧光信号标签；正向引物2的5’端带有hex荧光信号标签，如果检测到的材料是纯合基因型，扩增的时候只会选其中对应的一个正向引物扩增与共用反向引物结合(例如，纯合gg型能与f-fam和共用反向引物结合，产生蓝色荧光)，根据荧光的差异，分辨出所测材料是aa型还是gg型，如果检测的材料是杂合ga型的，扩增时2个引物都会结合，产生的红、蓝两种荧光信号(显示为绿色)，不同于纯合基因型的材料，从而实现区分杂合基因型。

34、若在snp位点检测到碱基g，为连接fam荧光标签序列的等位基因型，荧光信号显示为蓝色，则判定待测桂花为纯合基因型gg；若检测到碱基a，为连接hex荧光标签序列的等位基因型，荧光信号显示为红色，则判定待测桂花为纯合基因型aa；若同时检测到碱基g和a，为同时连接fam荧光标签序列和hex荧光标签序列的中间型，荧光信号显示为绿色，则判定待测桂花为杂合基因型ga。

35、在本发明应用较佳的实施方式中，pcr扩增所使用的反应体系以10μl计包括：待测样本的基因组dna 10-100ng，kasp分子标记引物组0.05-1.0μl，kasp反应预混液5μl和余量的水；pcr扩增反应的程序为：95℃预变性10min；95℃变性10-20s，61℃-55℃退火40s-60s，共10个循环，每个循环降低0.6℃；95℃变性15s-20s，55℃退火40-60s，共33-42个循环；在30-40℃荧光读取30-40s。

36、在一种可选的实施方式中，kasp分子标记引物组中正向引物1、正向引物2和反向引物的摩尔比为1:1:2。

37、第六方面，本发明还提供了kasp分子标记引物组或上述的试剂或试剂盒在桂花结实能力早期鉴定或桂花辅助育种方面的用途。

38、本发明提供的kasp分子标记引物组能用于选出所期望的桂花品种，该snp分子标记具有可靠性和可用性。实验证明，本发明所获得的kasp分子标记能用于快速精准地鉴定桂花该位点的基因分型，帮助选取结实性符合预期的种质材料。

39、本发明具有以下有益效果：

40、1)本发明提供了一个与桂花结实性状相关的显著位点，该位点位于3号染色体第6301644bp碱基，通过该分子标记中的单碱基差异设计了kasp检测的引物组合，可直接用于桂花结实能力和对应基因型的鉴定，进而依赖该分子标记进行辅助育种，加快育种效率。

41、2)通过该标记在桂花的幼苗期可以提前预测生殖期的结实情况，快速筛选到目标植株，提高产业上对不同育性植株选择的效率和准确性。

42、3)本发明在桂花品种分类和雄全异株繁育体系理论研究上均具有重要意义。