迈诺醇的生产的制作方法

本文提供了使用柯巴基(copalyl)二磷酸合酶和香紫苏醇合酶生产(+)-迈诺醇(manool)的生物化学方法。

背景技术：

1、在大多数生物(微生物、动物和植物)中都可以找到萜烯。这些化合物由称为异戊二烯单元的五个碳单元组成，并按其结构中存在的这些单元的数量分类。因此，单萜、倍半萜和二萜分别是含有10、15和20个碳原子的萜烯。例如，倍半萜在植物界广泛存在。许多倍半萜分子因其风味和香味性质以及它们的美容、医疗和抗微生物作用而公知。许多倍半萜烃和倍半萜类化合物已被鉴定出。

2、萜烯的生物合成生产涉及称为萜合酶的酶。这些酶将无环萜烯前体转化成一种或多种萜烯产物。具体而言，二萜合酶通过前体香叶基香叶基二磷酸(ggpp)的环化产生二萜。ggpp的环化通常需要两种酶多肽，在两个连续的酶促反应中组合起作用的i型和ii型二萜合酶。ii型二萜合酶催化由ggpp的末端双键质子化引发的ggpp的环化/重排，导致环状二萜二磷酸酯中间体。然后该中间体被催化电离引发的环化的i型二萜合酶进一步转化。

3、二萜合酶存在于植物和其他生物中，并使用底物如ggpp，但它们具有不同的产物特征。编码二萜合酶的基因和cdna已经被克隆，并且表征了相应的重组酶。

4、柯巴基二磷酸(cpp)合酶和香紫苏醇合酶是植物中存在的酶。因此，需要在生物化学过程中发现和使用这些酶和变体以产生(+)-迈诺醇。

技术实现思路

1、本发明提供一种生产(+)-迈诺醇的方法，包括：

2、a)使香叶基香叶基二磷酸(ggpp)与柯巴基二磷酸(cpp)合酶接触以形成柯巴基二磷酸，其中该cpp合酶包含：

3、i)与从由seq id no:14和seq id no:15构成的群组中选出的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或者

4、ii)与从由seq id no:17和seq id no:18构成的群组中选出的多肽具有至少71％、72％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或者

5、iii)与从由seq id no:20和seq id no:21构成的群组中选出的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和

6、b)使cpp与香紫苏醇合酶接触以形成(+)-迈诺醇；并且

7、c)可选地，分离(+)-迈诺醇。

8、本文提供的方法还包括进一步将(+)-迈诺醇加工成(+)-迈诺醇衍生物。

9、本文还提供了具有cpp合酶活性的多肽，其中该多肽包含：

10、a)与从由seq id no:14和seq id no:15构成的群组中选出的多肽具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或者

11、b)与从由seq id no:17和seq id no:18构成的群组中选出的多肽具有至少71％、72％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或者

12、c)与从由seq id no:20和seq id no:21构成的群组中选出的多肽具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

13、还提供了具有香紫苏醇合酶活性的多肽，其中该多肽包含与从由seq id no:4、seq id no:5、seq id no:23和seq id no:25构成的群组中选出的多肽具有至少90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

14、本文还提供了编码上述多肽的核酸。

15、本文还提供了编码cpp合酶的核酸，其中该核酸包含与seq id no:13、seq id no:16、seq id no:19、seq id no:22、seq id no:26、seq id no:29、seq id no:30、seq idno:31或seq id no:32中所示的核酸序列具有至少90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

16、本文进一步提供了编码香紫苏醇合酶的核酸，其中该核酸包含与seq id no:6、seq id no:24、seq id no:27、seq id no:33或seq id no:34具有至少90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。

17、还提供了包含上述核酸的表达载体，包含上述核酸或包含该表达载体的非人宿主生物体或细胞，能够生产ggpp的非人宿主生物体或细胞，转化非人宿主生物体或细胞的方法，以及培养非人宿主生物体或细胞以生产(+)-迈诺醇的方法。

技术特征：

1.一种生产(+)-迈诺醇的方法，包括：

2.权利要求1所述的方法，其中该cpp合酶包含：

3.权利要求1的方法，其中步骤a)包括在有利于cpp生产的条件下培养能够生产ggpp并经转化以表达至少一种多肽的非人宿主生物体或细胞，该至少一种多肽包含：

4.权利要求1或2的方法，其中该方法还包括，在步骤a)之前，用如下物质转化能够生产ggpp的非人宿主生物体或细胞：

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中该具有香紫苏醇合酶活性的多肽包含与seq id no:4、seq id no:5、seq id no:23或seq id no:25具有至少98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，还包括使用化学或生物化学合成或两者的组合将(+)-迈诺醇加工成(+)-迈诺醇衍生物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中该衍生物是醇、缩醛、醛、酸、醚、酮、内酯、乙酸酯和/或酯。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中该衍生物是从由柯巴醇、柯巴醛、迈诺醇氧基、z-11、γ-ambrol和降龙涎香醚构成的群组中选出的。

9.一种转化宿主细胞或非人生物体的方法，包括用编码具有柯巴基二磷酸合酶活性的多肽的核酸和编码具有香紫苏醇合酶活性的多肽的核酸转化宿主细胞或非人生物体，

10.根据权利要求4～9中任一项所述的方法，其中该宿主细胞或非人生物体是植物、原核生物或真菌。

11.根据权利要求4～10中任一项所述的方法，其中该非人宿主生物体或细胞是大肠杆菌(e.coli)或酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。

12.一种表达载体，包含：

13.权利要求12的表达载体，还包含：

14.一种非人宿主生物体或细胞，包含：

15.权利要求14的非人宿主生物体或细胞，其中该非人宿主生物体或细胞是植物、原核生物、真菌、大肠杆菌(escherichia coli)或酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。

技术总结
本发明提供了生产(+)‑迈诺醇的方法，包括：使香叶基香叶基二磷酸与柯巴基二磷酸(CPP)合酶接触以形成(9S,10S)‑柯巴基二磷酸，并使CPP与香紫苏醇合酶接触以形成(+)‑迈诺醇及其衍生物。还提供了在该方法中使用的编码CPP合酶和香紫苏醇合酶的核酸。还提供了表达载体和非人宿主生物体以及细胞，其包含如本文所述的编码CPP合酶和香紫苏醇合酶的核酸。

技术研发人员：M·沙尔克,L·戴维特,L·洛奇,D·索利斯艾斯卡兰特
受保护的技术使用者：弗门尼舍有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29