一种石油降解菌及其固定化方法与应用

本发明属于生物修复，涉及一种石油降解菌及其固定化方法与应用。

背景技术：

1、近年来，人们对石油的需求加大，在石油开采、冶炼、运输和使用过程中，每年泄露到环境中得石油有成千上万吨，既破坏了环境，又对人类的健康造成威胁，根据全国土壤污染状况调查公报在调查的13个采油区的494个土壤点位中，超标点位占23.6％，主要污染物为石油经和多环芳烃。现有的石油污染修复技术中的物理法和化学法很难完全达到修复要求，成本高且容易造成二次污染，在使用物理化学法作为预处理手段，生物技术作为最终修复手段是一条更经济、高效的途径。但是石油成分复杂难以降解，目前国内外对石油污染物的微生物修复研究较少。

2、专利cn106811426a(申请号：201510853839.4)公开了一种用于乳化原油的热堆肥芽孢杆菌(bacillus thermocopriae)blg69菌株、培养方法及应用，该菌株能够以原油作为唯一碳源，在37℃～60℃的温度下产生乳化剂，降低原油粘度，该菌株对油藏环境具有良好的适应能力，可以通过向油藏内注入能够促进其生长代谢的激活剂来达到提高原油采收率的效果，但是其需要在45℃以上的温度培养72小时以上，较难现场发酵。

3、专利cn104342392b(申请号：201410601152.7)公开了一株氧化微杆菌及其应用，能以原油或者多环芳烃为唯一的碳源在好氧和厌氧条件下乳化降解原油，降解后的多环芳烃如萘的降解率达到100％，降解后的原油分析发现对原油组分中主要降解芳香烃和胶质部分，但是对原油中脂肪烃的降解效果并没有做出说明。

4、专利cn108048376b(申请号：201810115877.3)公开了一株从辽河油田含油污泥中筛选出的石油降解菌假单胞菌属pseudomonas sp.的筛选方法与其对含油污泥的降解效果，该菌株对长链烷烃具有明显的降解能力，对霍烷的降解能力较强，30天对含油污泥中总石油烃降解率为61.81％，但是只对游离菌进行了实验，并没有固定化，游离菌对环境耐受性较差。

5、专利cn113801820a(申请号：202111132305.4)公开了一种石油降解菌的筛选方法及固定化方法和该固定化菌剂的应用，将筛选到的6种石油降解菌按比例加入到改性后的径聚氨酯泡沫中制备出固定化菌剂，该菌剂对石油烃含量为1％土壤去除率达到90％以上，但改性后的聚氨酯泡沫耐生物降解，给土壤引入了新污染物。

6、现有部分技术直接利用微生物发酵液降解原油，但是发酵液体积较大，运输不便，并且无法长期储存，将石油降解菌固定化后制成菌剂，是目前较为常用的方法，固定化载体主要有化学载体和天然载体两种，化学载体稳定性高，对微生物和石油都有更好的吸附效果，并且对环境有很高的耐受性，但是成本较高并且会引入新污染物，天然载体例如的海藻酸钠包埋法虽然便于储存且对环境有一定耐受性，但是成本较高，不适于大规模生产。

7、秸秆是农业废弃物，一般焚烧处理，不仅浪费了资源，还会造成的空气污染，而秸秆生物炭可以改良土壤，调节酸碱，并且能够吸附土壤重金属，用秸秆与生物炭作为固定化的材料，不仅提高了微生物降解原油的效果，而且秸秆进行了资源化利用，变废为宝。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一株耐碱、耐高浓度石油烃、耐盐的高效石油烃降解菌株与其固定化方法和应用。本发明以天然有机材料和无机材料混合为载体，解决了传统微生物发酵液使用不便利与菌剂成本高以及引入新污染物的问题。

2、本发明技术方案如下：

3、一种石油烃类降解菌，命名为吉氏不动杆菌acinetobacter gyllenbergii-shc，于2023年9月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmcc no.28392。

4、上述石油烃类降解菌的dna序列如seq id no.1所示。

5、seq id no.1：

6、aagggtagcttgctacctaacctagcggcggacgggtgagtaatgcttaggaatctgccatttagtgggggacaacattccgaaaggaatgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggatcttcggaccttgcgctaaatgatgagcctaagtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatctgtagcgggtctgagaggatgatccgccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcggaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttttggttgtaaagcactttaagcgaggaggaggctactagtactaatactactggatagtggacgttactcgcagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcgagcgttaatcggatttactgggcgtaaagcgtgcgtaggcggctttttaagtcggatgtgaaatccccgagcttaacttgggaattgcattcgatactgggaagctagagtatgggagaggatggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaaggcagccatctggcctaatactgacgctgaggtacgaaagcatggggagcaaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgtctactagccgttggggcctttgaggctttagtggcgcagctaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagactaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatagtaagaactttccagagatggattggtgccttcgggaacttacatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttttccttatttgccagcgagtaatgtcgggaactttaaggatactgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgctacctagcgataggatgctaatctcaaaaagccgatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgttgcaccagaagtaggtagtctaaccgtaa

7、上述石油降解菌的固定化方法，以玉米秸秆生物炭、玉米秸秆、硅藻土混合均匀后作为固定化培养基，将活化后的石油降解菌种子液与固定培养基混合培养，吸附固定，获得石油烃降解菌剂；具体步骤如下：

8、步骤1、玉米秸秆生物炭制备

9、将玉米秸秆洗涤切成1-2cm长的片状，在65～100℃烘箱中干燥10-24h，然后将玉米秸秆置于缺氧状态下，以5-10℃/min的加热速率加热至在400-550℃，保温3-6h，制得玉米秸秆生物炭。

10、步骤2、固定化培养基配置

11、将玉米秸秆生物炭20～50重量份、玉米秸秆20～40重量份和硅藻土10～20重量份，加入富集培养基中灭菌，获得固定化培养基。

12、步骤3、石油降解菌固定化

13、挑取acinetobacter gyllenbergii.shc单菌落于lb液体培养基中于30～37℃、150～220rpm，活化8～24h制成种子液，种子液加入固定化培养基于30～37℃、150～220rpm震荡培养36～48h，使用无菌生理盐水冲洗，自然风干得到石油烃降解菌剂。

14、上述的石油降解菌应用于石油污染土壤的降解。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果：

16、(1)本发明提供的石油降解菌对营养贫瘠条件下对石油烃具有良好的降解效果最好。

17、(2)本发明用玉米秸秆生物炭、玉米秸秆、硅藻土混合均匀后作为固定化载体，无机载体硅藻土作为稳定剂，可以使固定化载体有更好的稳定性，玉米秸秆一般焚烧处理，使用玉米秸秆作为有机载体材料，其比表面积大，吸附性能强，使废弃的秸秆得到资源化利用，秸秆生物炭还可以作为土壤改良剂调节酸碱、吸附重金属，使微生物更好的适应环境。

18、(3)本发明菌种稳定性高，耐受极端环境，微生物菌剂制作工艺简单，原材料便宜，生产费用低。