一种基于RPA-CRISPR-Cas12a系统的鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测方法及应用

本发明属于生化与分子生物学，涉及一种基于rpa-crispr-cas12a系统的鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测方法及应用。

背景技术：

1、自2020年7月以来，一种以肝脾白灶性坏死为特征的传染病在中国许多地区的鹅场广泛传播，给我国养鹅业造成了严重的经济损失。经分离、培养、生物学鉴定、基因组序列分析，确定该病原为鹅源番鸭呼肠孤病毒(g-mdrv)。开发快速、准确且便捷的核酸检测方法是成功预防和控制感染的关键。传统核酸检测技术如rt-pcr、巢氏rt-pcr以及灵敏度更高的实时荧光定量rt-pcr等，不仅需要昂贵仪器设备，而且需要专业人士操作，限制了它们在采样现场或设备不足的实验室中的应用。因此，如何更加快速、简便、准确、灵敏地检测，是mdrv核酸检测未来的发展方向。

2、规律成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，crispr)及其相关蛋白(crispr-associated proteins，cas)构成crispr-cas系统。研究表明，crispr-cas系统不仅具有基因编辑能力，还可用于病原的核酸检测。随着对crispr-cas系统的深入研究，已有多种crispr-cas系统被开发为快速、灵敏的核酸检测技术。其中ⅱ类cas12a蛋白可在grna引导下具有优异的靶基因序列特异性识别能力和高效的反式切割活性，已被开发成识别不同类型靶标的核酸检测方法，在快速检测领域具有重大潜力。

3、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)是一种等温扩增技术，因其具有反应迅速、特异性强、低温运行、灵敏度高、适用性广、试剂形态灵活等优势广泛用于病原核酸检测。为提高crispr-cas12a系统的灵敏度，将rpa与cas12a介导的反式切割活性相结合，可在极低拷贝水平检测到靶标核酸分子。

4、现有技术中，已有结合rpa与crispr-cas系统检测病毒核酸的相关专利申请，如：cn 114292963a公开了一种鸭坦布苏病毒核酸crispr-cas13a检测系统及rpa引物对和crrna，可对鸭坦布苏病毒进行特异性检测。cn 115786582 a则公开了一种结合rpa与crispr/cas12a检测猴痘病毒方法、试剂盒及其制备方法，该检测系统可在30-40min内检测猴痘病毒的基因组dna，检测限为1copy/μl，可以实现快速、灵敏地猴痘病毒检测。但是，对于鹅源番鸭呼肠孤病毒，目前尚无结合rpa与crispr-cas系统进行检测的相关报道，所以本领域的技术人员致力于开发一套基于rpa-crispr-cas12a系统，用于g-mdrvσc基因的简便快速检测。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于rpa-crispr-cas12a系统的g-mdrv可视化检测方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明采用rpa、crispr-cas12a系统、荧光实时监测、测流层析技术相结合的方法，推动了g-mdrv诊断技术的发展，为防控g-mdrv病提供技术支持。

2、为实现上述目的，本发明主要包括以下内容：

3、本发明第一方面，提供了一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的引物-探针组合，所述引物-探针组合包括：特异性rpa引物对，grna，ssdna检测探针；

4、所述特异性rpa引物对的核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.2所示；

5、所述grna的核苷酸序列如seq id no.3所示；

6、所述ssdna检测探针为用于荧光检测的ssdna 1-荧光淬灭探针或用于试纸条检测的ssdna 2-荧光生物素探针。

7、所述ssdna 1-荧光淬灭探针为一端标记有荧光基团fam和另一端标记有荧光淬灭基团bhq1的单链dna，所述ssdna 2-荧光生物素探针为一端标记有荧光基团fitc和另一端标记有生物素基团biotin的单链dna。

8、所述单链dna的核苷酸序列为：ttatt。

9、本发明第二方面，提供上述的引物-探针组合在制备检测鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测产品中的应用。

10、本发明第三方面，提供了一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的试剂盒，所述试剂盒含有上述检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的引物-探针组合；

11、所述试剂盒还包括：cas蛋白，鹅源番鸭呼肠孤病毒质粒标准品，反应缓冲液；

12、所述cas蛋白为cas12a蛋白；

13、所述反应缓冲液为10×reaction buffer。

14、所述鹅源番鸭呼肠孤病毒质粒标准品由如下方法制备而成：

15、采用seq id no.1-seq id no.2所示的特异性rpa引物对扩增鹅源番鸭呼肠孤病毒的基因组，得到扩增产物，将扩增产物连接到pmd18-t载体上，筛选阳性克隆并提取质粒dna，即制备得到鹅源番鸭呼肠孤病毒质粒标准品；

16、本发明第四方面，提供了鹅源番鸭呼肠孤病毒检测试剂盒在进行鹅源番鸭呼肠孤病毒流行病学调查中的应用。

17、本发明第五方面，提供了一种对鹅源番鸭呼肠孤病毒进行可视化检测的方法，包括如下步骤：

18、(1)提取待测样品的rna，反转录为cdna；

19、(2)以(1)中获得的cdna为模板，与特异性rpa引物对结合进行扩增反应，得到扩增产物；

20、(3)将扩增产物与含有cas12a蛋白、grna的系统混合，并加入ssdna检测探针进行反应；

21、(4)用可视化检测仪器或检测试纸条对反应产物进行检测观察，并对观察结果进行判读，若用可视化检测仪器检测反应产物时发出荧光信号或用检测试纸条检测反应产物时检测线位置出现红色条带或检测线和质控线位置均出现红色条带，则表明待测样品中存在鹅源番鸭呼肠孤病毒。

22、本发明具有以下有益效果：

23、本发明提供了一种快速、灵敏、高特异性且能满足现场快速检测技术需求的靶标鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测方法，可有效脱离实验室昂贵的热循环仪器，对于鹅源番鸭呼肠孤病毒的快速防控具有重要的指导意义。

技术特征：

1.一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的引物-探针组合，其特征在于，所述引物-探针组合包括：特异性rpa引物对，grna，ssdna检测探针；

2.根据权利要求1所述的一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的引物-探针组合，其特征在于，所述ssdna 1-荧光淬灭探针为一端标记有荧光基团fam和另一端标记有荧光淬灭基团bhq1的单链dna，所述ssdna 2-荧光生物素探针为一端标记有荧光基团fitc和另一端标记有生物素基团biotin的单链dna。

3.根据权利要求2所述的引物-探针组合，其特征在于，所述单链dna的核苷酸序列为：ttatt。

4.权利要求1-3任一项所述的引物-探针组合在制备检测鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测产品中的应用。

5.一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-3任一项所述的引物-探针组合。

6.根据权利要求5所述的一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：cas蛋白，鹅源番鸭呼肠孤病毒质粒标准品，反应缓冲液。

7.根据权利要求6所述的一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的试剂盒，其特征在于，所述cas蛋白为cas12a蛋白；所述反应缓冲液为10×reaction buffer。

8.根据权利要求5所述的一种检测鹅源番鸭呼肠孤病毒的试剂盒，其特征在于，所述鹅源番鸭呼肠孤病毒质粒标准品由如下方法制备而成：

9.权利要求5-8任一项所述的试剂盒在进行鹅源番鸭呼肠孤病毒流行病学调查中的应用。

10.一种对鹅源番鸭呼肠孤病毒进行可视化检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR‑Cas12a系统的鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测方法及应用，属于生化与分子生物学技术领域。通过提取待测样品的RNA，反转录为cDNA，以获得的cDNA为模板，与特异性RPA引物对结合进行扩增反应，得到扩增产物，将扩增产物与含有Cas12a蛋白、gRNA的系统混合，并加入ssDNA检测探针进行反应；最后使用可视化检测仪器对反应产物进行观察。本发明提供了一种能快速、灵敏、高特异性且能满足现场快速检测技术需求的靶标鹅源番鸭呼肠孤病毒可视化检测方法，可有效脱离实验室昂贵的热循环仪器，对于鹅源番鸭呼肠孤病毒的快速防控具有重要的指导意义。

技术研发人员：贺大林,唐熠,刁有祥
受保护的技术使用者：山东农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25