抗CD28抗体及其应用的制作方法

本发明涉及cd28激动活性抗体，属于抗体领域和癌症免疫治疗领域。

背景技术：

1、cd28组成性表达于人类95％的cd4+t细胞、50％的cd8+t细胞、70％γ/δcd3+外周血t细胞、浆细胞以及部分nk细胞表面，在人、猿、小鼠、大鼠及禽类的淋巴细胞表面均存在，这使得其成为大部分t细胞的辅助激活信号。

2、cd28由igv样胞外区、疏水跨膜区和高度保守的胞内区三部分组成。去掉n端含18个氨基酸的信号肤，成熟cd28单体由202个氨基酸组成，相对分子量为44kda。其胞膜外区由134个氨基酸组成，含有5个n糖基化位点，跨膜区含有27个氨基酸，膜内区含有41个氨基酸，通过链间二硫键连接成同源二聚体。cd28胞外区结构与igv相似，带有片层结构和3个互补决定区(cdr)样的环状结构，其中cdr3样环上高度保守的mypppy基序是选择性结合b7家族分子的关键部位。cd28胞质区含有供sh2(src-homology 2)和sh3结合的区域，可与多种信号分子和激酶相互作用，为信号转导所必需。在未致敏的t细胞表面，cd28是b7.1和b7.2的唯一受体。

3、激动性抗体或apc表面表达的cd80/cd86配体刺激后，人cd28而非小鼠cd28也能够充当独特的信号受体，并产生非tcr依赖性t细胞激活信号。实际上，在没有tcr参与的情况下，人cd28刺激会激活外周cd4+中的nf-κb途径t细胞。

4、靶向cd28的疗法具有增强t细胞抗癌作用，但由于cd28激动剂tgn1412于2006年进行的临床研究显示出了令人担忧的安全性，多年来针对这一靶点的药物研发进展甚微。当t细胞的表面受体被治疗性单克隆抗体激活时，会引起细胞因子风暴。2019年11月18日，sanofi的研发团队报道了一种同时靶向cd38、cd3和cd28的三特异性抗体，当给猴子静脉注射该三特异性抗体时，研究人员观察到了细胞因子相关的毒性，但包含cd28结合域的这一分子并没有导致无法应付的细胞因子风暴，因此新型的cd28共刺激双或/和多特异性抗体可能扩大免疫疗法的范围。

5、基于此，本发明提供了一种新型具有激动剂活性的抗cd28抗体。

技术实现思路

1、本发明提供一种抗cd28抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区序列vh，所述重链可变区序列vh包含hcdr1、hcdr2和hcdr3，其中所述hcdr1、hcdr2和hcdr3为如下的氨基酸序列：

2、(1)分别为seq id no:5、6和7；或

3、(2)分别为seq id no:11、12和13。

4、根据本发明的实施例，本发明所述的抗体或其抗原结合片段，进一步包含轻链可变区vl，所述轻链可变区vl包含lcdr1、lcdr2和lcdr3，其中所述lcdr1、lcdr2和lcdr3为如下的氨基酸序列：

5、(1)分别为seq id no:8、9和10；或

6、(1)分别为seq id no:14、15和16。

7、根据本发明的实施例，本发明所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区序列vh和轻链可变区vl包含如下cdr组合：

8、(1)：

9、hcdr1、hcdr2和hcdr3分别为seq id no:5、6和7；

10、lcdr1、lcdr2和lcdr3分别为seq id no:8、9和10；

11、(2)：

12、hcdr1、hcdr2和hcdr3分别为seq id no:11、12和13；

13、lcdr1、lcdr2和lcdr3分别为seq id no:14、15和16。

14、本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区vh，所述重链可变区vh包含与seq id no:1或3具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

15、根据本发明的实施例，本发明所述的抗体或其抗原结合片段进一步包含轻链可变区vl，所述轻链可变区vl包含与seq id no:2或4具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

16、根据本发明的实施例，本发明所述的抗体或其抗原结合片段包含如下重链可变区vh和轻链可变区vl的组合：

17、(1)vh：seq id no:1；vl：seq id no:2；

18、(2)vh：seq id no:3；vl：seq id no:4。

19、在另一方面，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其满足以下二项中至少一项：

20、(1)所述抗体为全长抗体；所述抗原结合片段选自fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(mru)；

21、(2)所述抗体为小鼠、嵌合或人源化抗体。

22、根据本发明的实施例，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含重链恒定区(ch)，所述轻链包含轻链恒定区(cl)，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体或灵长目源抗体的至少之一。

23、根据本发明的实施例，所述抗体的重链恒定区和轻链恒定区均来自于人源igg抗体。

24、根据本发明的实施例，所述抗体的重链恒定区包含如seq id no:17所示的氨基酸序列；轻链恒定区包含如seq id no:18所示的氨基酸序列。

25、其中seq id no:17为人igg1 lala ds序列，该序列为人igg1恒定区进行了三个位点的氨基酸突变，位置234-235的两个氨基酸ll变为aa及位置265的一个氨基酸d变为s，具体序列为：

26、astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvsvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykck vsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk；

27、其中seq id no：18为人kappa链恒定区，具体序列为：rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslss tltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。

28、进一步，本发明提供核酸分子，所述核酸分子编码上述抗cd28抗体或其抗原结合片段。

29、进一步，本发明提供一种载体，所述的载体含有上述核酸分子。

30、进一步，本发明提供一种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞含有上述的载体或染色体中整合有外源的上述核酸分子或表达上述抗cd28抗体或其抗原结合片段。

31、进一步，本发明提供抗体或其抗原结合片段、上述核酸分子、上述载体、上述细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

32、进一步，本发明提供一种药物组合物，其包含权利要求1-11任一项所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的佐剂。

33、进一步，本发明所述的药物组合物，为包被抗cd3抗体和本发明cd28抗体的磁珠。

34、本发明相关术语的解释

35、除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。

36、本发明所述的“抗体(antibody)”包括全长抗体、全长抗体的抗原结合片段以及包含抗体cdr、vh区和/或vl区的分子。抗体的实例包括(但不限于)单克隆抗体、以重组方式产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、鼠抗人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、抗体-药物缀合物、单域抗体、单价抗体、单链抗体或单链fv(scfv)、骆驼化抗体以及以上任一个的抗原结合片段。

37、本发明优选的抗体形式包括fab、fab′、fv、scfv、(fab′)2片段。

38、fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。术语fab′通常是指在重链ch1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于fab的片段，其一般由(fab′)2还原得到。

39、fv指的是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。

40、scfv指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。

41、(fab′)2指的是fab′的二聚体。

42、本发明的抗体形式还包括单域抗体(纳米抗体)、双特异性抗体或最小识别单位。

43、术语“单域抗体”也被称为“纳米抗体”，是指仅包含一个重链可变区的抗体,，因此也称为vhh抗体。

44、术语“双特异性抗体”是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，其可以为本领域已知的任何形式。

45、最小识别单位或分子识别单位(molecular recognition unit,mru)：抗体与抗原的结合主要涉及cdr，而cdr中以cdr3尤其重链cdr3最为关键。基于这一事实有人用来自cdr的短肽模拟了亲本抗体的特异结合活性，证实cdr确有可能成为特异结合抗原的最小分子，被称为最小识别单位或分子识别单位。

46、本发明还包括抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体，保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明的抗cd28激动活性性质的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。

47、本发明所述的抗体，还包括cdr区之外抗体重链可变区氨基酸序列和抗体轻链可变区氨基酸序列具有80％以上，或90％以上，或95％以上，或99％以上同一性的序列。

48、在本发明中，术语“同一性”或“同源性”通常是指将候选序列中核苷酸碱基或氨基酸残基与相应序列进行比较，经序列比对和必要情况下引入间隔以实现整段序列的最大相同百分数并且不把任何保守取代视为序列同一性的一部分后，二者碱基或残基相同的比例。无论n端或c端延伸或插入均不应理解为降低同一性或同源性。对于比对的方法和计算程序均可获得，并为本领域所熟知，例如，可以通过序列分析软件测定序列同一性。

49、本发明中的术语“vh区”和“vl区”分别是指包含fr(框架区)1、2、3和4以及cdr(互补决定区)1、2和3的单一抗体重链和轻链可变区。

50、本发明所述的“cdr”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点，对抗体可变区进行cdr和fr区域的标注，需要选择一种编号系统，编号方案(antibody numbering scheme)有：imgt,chothia,kabat,martin(扩展版chothia)等，如无特殊说明，本发明使用chothia编号规则。

51、本发明中的术语“vl”和“vl区”指抗体的轻链可变区。

52、本发明中的术语“vh”和“vh区”指抗体的重链可变区。

53、本发明中的术语“恒定区”是本领域中常见的。恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合但可以展现各种效应功能，如与fc受体(例如fcγ受体)的相互作用的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基端部分。其中在igg1亚类的fc区引入lala突变(l234a，l235a)，可以降低抗体与fcγ受体和其补体(complement)的结合，但不影响体内的药物动力学。免疫球蛋白分子的恒定区通常具有相对于免疫球蛋白可变结构域来说更为保守的氨基酸序列。

54、本发明中的术语“嵌合抗体”是指“人-鼠嵌合抗体”，是将鼠源单抗的轻链、重链可变区插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞进行表达所产生的单克隆抗体。

55、本发明中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即集群中的抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。本发明中，术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。

56、本发明中，术语“载体”通常是指能够转运与它连接的另一个核酸分子，并在合适的宿主中自我复制的核酸分子。载体包括任何遗传元件，例如质粒、转座子、人工染色体、病毒等，其在与适当的控制元件组合时能够进行自我复制并且将基因序列转移到宿主或宿主之间。

57、本发明中，术语“kd”、“kd”或“kd”可互换使用，通常是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。本发明中使用的“kd”是解离速率常数(kdis，也称为“解离率(off-rate)(koff)”或“kd”)与结合速率常数(kon，也称为“结合率(kon)”或“ka”)的比值。