一种循环持续发酵鼠李糖脂的方法与流程

本发明属于生物，涉及一种循环持续发酵鼠李糖脂的方法。

背景技术：

1、鼠李糖脂是目前应用最为广泛的一种高效阴离子生物表面活性剂，具有乳化、起泡、抗菌、抗病毒和抗支原体等多种功能，目前主要应用于精细化工、石油开采、环境保护、土壤修复等领域。

2、鼠李糖脂的制备主要采用微生物发酵法，该法存在下列优点：a.利用微生物的代谢过程能够生成结构复杂的目标分子，其他方法来合成较为困难，此外，还可通过基因工程手段修饰或改变微生物的生物转化途径，从而改造复杂的分子结构，使其性能更优越。b.原料来源广泛，产物可完全降解，发酵液对人体无毒，对环境危害小。c.发酵生产工艺简单，成本低廉，安全经济，具有良好的工业价值。当然，该法也存在缺点，如发酵液中产物浓度较低，产物被分泌到胞外，使得产物分离和纯化较为麻烦。

3、鼠李糖脂产品属于环保类产品，与传统化学类表面活性剂产品相比具有产品稳定性好、适用范围广、绿色环保、可生物降解、不会带来二次污染等优点。

4、鼠李糖脂是由一个或两个鼠李糖分子与一个或两个不同链长的3-羟基脂肪酸通过β-糖苷键连接而成的一种化学结构不均一的次生代谢产物，其中鼠李糖构成其亲水基团，脂肪酸构成其疏水基团。常见的鼠李糖脂都是一种混合物，除特定实验用途外，一般的产品中都包含多种同族化合物。目前有统计显示，已经报道的鼠李糖脂结构多达28种，各种同系物之间的差异主要来自于糖基部分与糖苷配基部分修饰的差异。大体上可以分为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。鼠李糖脂产物的具体结构受到菌种、碳源种类、碳氮比以及发酵温度等相关参数的影响。在大规模的工业发酵过程中，产物中常见的鼠李糖脂结构有四种，分别是双糖双脂结构rl1，单糖双脂结构rl2，双糖单脂结构rl3，单糖单脂结构rl4。

5、发酵鼠李糖脂的产量不仅受氮源种类的影响，也显著地受c/n比例的影响，营养条件会显著影响相关基因的表达进而影响鼠李糖脂的生物合成。许多研究结果显示疏水性碳源较亲水性碳源而言，有利于获得高产量的鼠李糖脂。若发酵工艺设计不合理，鼠李糖脂产率会低，且存在发酵过程中由于鼠李糖脂的产生导致发酵液中泡沫增多，发酵过程中通风量小，菌种供氧量不足，影响发酵过程中的菌种代谢速度等问题。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提高发酵鼠李糖脂的合成产率和底物转化率。

2、为此，本发明提供一种循环持续发酵鼠李糖脂的方法，包括如下步骤：

3、(1)将产鼠李糖脂的微生物在发酵培养基中进行发酵培养；

4、(2)发酵24-28 h时，流加碳源和氮源；开始流加碳源和氮源后至发酵48-52 h过程中控制碳氮比为200-400:1；之后，控制碳氮比为80-100:1；碳源流速固定为每分钟流加初始发酵体积的0.02-0.04%，根据碳氮比调节氮源流速；

5、(3)当发酵液体积达到初始发酵体积的150%-200%并且鼠李糖脂合成产率大于80g/l时，取出1/3-2/3体积的发酵液，发酵罐中的发酵继续进行；将取出的发酵液进行固液分离，得到发酵液上清和菌体沉淀；将所述发酵液上清用于提取鼠李糖脂；将所述菌体沉淀经过破菌处理后制成菌体补料；

6、(4) 在步骤(3)取出发酵液4-6 h后，流加所述菌体补料，流速为每分钟流加初始发酵体积的0.01-0.03%；

7、(5) 继续发酵培养，重复步骤(3)-(4)至少一次；

8、该循环持续发酵鼠李糖脂的方法可以持续至少1248 h。

9、在一些实施方案中，上述方法中，所述发酵培养基的组成为：甘油 2-3%、nano30.5-2%、kh2po40.05-0.1%、na2hpo4·12h2o 0.05-0.1%、mgso4·7h2o 0.01-0.1%、cacl2·2h2o 0.5-0.8%、feso40.01%-0.1%、cocl20.01%-0.1%，余量为水。

10、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述发酵培养的初始ph 为6.8-7.4，例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4，或这些数值任意二者之间的范围或数值。

11、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述发酵培养的初始od600为0.8-4，例如2-3，再例如2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0，或这些数值任意二者之间的范围或数值。

12、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述发酵培养的发酵温度为25-40℃，例如35-37℃；初始搅拌150-200 rpm、初始通气0.2-0.6 vvm，发酵过程中随着溶氧的下降逐渐提高转速和通气量，保证溶氧＞20%。

13、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，步骤(2)中流加的所述碳源为含有10-30 g/100ml的甘油和10-30 g/100ml的丙烯-1,2-二醇的水溶液，优选其中甘油与丙烯-1,2-二醇的质量比为1:1。

14、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，步骤(2)中流加的所述氮源为经过除菌过滤的含有1-5 g/100ml 的nano3和0.1-1 g/100ml的谷氨酸的水溶液。

15、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述提取鼠李糖脂包括如下步骤：将所述发酵液上清的ph调节至1.5-2.4（例如1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4，或这些数值任意二者之间的范围或数值），鼠李糖脂在酸性条件下溶解度很低，会以沉淀的方式伴随杂质一起沉淀出来，静置得到沉淀；在沉淀中加入1/5-1/10体积的乙酸乙酯萃取，得到下层萃取液；将下层萃取液在80-85℃下蒸馏出乙酸乙酯，得到红色的含有鼠李糖脂及杂质的糊状物；再在该糊状物中加入1/5-1/10体积的乙酸乙酯萃取2-3次，得到下层萃取液，再置于80-85℃下蒸馏出乙酸乙酯，即得到鼠李糖脂纯品，其纯度达到92%以上。

16、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述破菌处理包括如下步骤：在所述菌体沉淀中加入溶菌酶进行酶解，再进行低温（2-8℃）高压破菌，在破菌后的均质液中加水配成20-50 g/100ml的菌体补料，灭菌（例如121℃、30分钟灭菌）。

17、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，在步骤(1)之前还进行了种子培养步骤；

18、所述种子培养时的种子培养基组成为：葡萄糖1-3%、nano30.5-3%、酵母膏0.5-2%、胰蛋白胨1-3%，余量为水，ph 7-7.4。

19、在一些实施方案中，上述方法中，所述种子培养包括两级种子培养步骤；

20、一级种子培养的条件为25-40℃、150-220 rpm培养26-30 h；例如33℃、180 rpm培养28 h；

21、二级种子培养的条件为25-40℃、200-250 rpm培养30-38 h；例如32℃、220 rpm培养35 h。

22、在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述产鼠李糖脂的微生物是假单胞菌微生物，优选铜绿假单胞菌( pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌( pseudomonas  fluorescens)、恶臭假单胞菌( pseudomonas putica)中的一种或多种。

23、本发明具有以下优势：

24、1、本发明发酵培养基中的微量元素钴与亚铁离子能促进合成鼠李糖脂；

25、2、本发明流加的碳源为甘油和丙烯-1,2-二醇，甘油与丙烯-1,2-二醇1:1组合是合成鼠李糖脂的前体物质，该碳源组合使鼠李糖脂合成更快；

26、3、本发明流加的氮源为nano3和谷氨酸，硝酸盐氮比氨态氮更能促进鼠李糖脂的产生，谷氨酸有利于菌体合成鼠李糖脂；

27、4、根据菌体生长不同时期的碳氮比需求不同，本发明在发酵前期控制碳氮比为200-400:1，有利于菌体快速生长；后期控制碳氮比为80-100:1，更有利于菌体合成鼠李糖脂；

28、5、发酵液上清的处理：三次乙酸乙酯萃取，大幅度提高收率和纯度；

29、6、本发明对发酵液的菌体沉淀进行了循环利用，通过酶解加低温高压破菌，使菌体内部未分泌出的鼠李糖脂释放出来，提高鼠李糖脂产量，且分离的菌体可以继续作为营养成分使用，极大地缩短了发酵周期，且减少了废弃物的产生，具有竞争性的成本优势；

30、7、采用本发明的工艺，鼠李糖脂的合成产率为86 g/l以上，底物转化率达到68%，且能持续保持该生产速度，可以实现鼠李糖脂不间断生产，可以至少放补9次，发酵1248 h以上，本发明的方法有效缓解有害代谢产物的积累，同时补加的菌体裂解物和补料正好契合菌体生长；

31、8、本发明不需要频繁配置培养基灭菌，不需要有复杂的过程调控，且发酵过程泡沫较少。

32、传统发酵方法生产鼠李糖脂的过程中，都是单批次逐批生产，发酵开始准备培养基，发酵过程消泡调控，后期分离菌液提取鼠李糖脂，该生产过程生产周期长，步骤重复繁琐，过程控制困难，菌渣被浪费，且效率低下。本发明的循环持续发酵鼠李糖脂的方法，通过优化培养基组成促进菌体快速成长、改善过程调控策略以减少泡沫产生，当发酵体积达到合适范围且鼠李糖脂合成速率最大时，按照比例进行放料，将放出发酵液分离上清用于提取鼠李糖脂，沉淀菌体经过处理后进行补料继续循环使用，使得菌体内部积累未分泌出的初级代谢产物鼠李糖脂重新返回到发酵液中。