一种催化合成莰烯的基因、生物酶及其在生产莰烯中的应用的制作方法

本发明属于生物酶催化，尤其涉及一种催化合成莰烯的基因、生物酶及其在生产莰烯中的应用。

背景技术：

1、莰烯，化学名称为camphene，是一种具有c10h16化学式的有机化合物。它在医药工业被广泛应用作为防腐剂，并且也是合成樟脑和香料等产品的重要原料。莰烯属于双环单萜类的化合物，几乎不溶于水，但可溶于常见的有机溶剂。它具有易挥发且气味刺鼻的性质。莰烯存在于各种油脂香料中，如松节油、柏油、樟脑油和香茅油等。在工业上，莰烯主要通过对常见的α-蒎烯进行催化异构化反应来生产。

2、然而，目前国内外的莰烯生产方法主要得到普通级别的产品，其莰烯含量约为96％左右。原因是当前莰烯蒸馏过程通常采用一次蒸馏，容易与其他类似物混合。然而，随着市场需求的扩大，尤其是在香料、医药和食品等领域，对高品质莰烯产品(莰烯含量98％以上)的需求不断增加。目前的工艺难以批量生产出莰烯含量超过98％的产品。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种催化合成莰烯的基因、生物酶及其在生产莰烯中的应用；本发明通过筛选获得高催化活性的生物酶，能够催化廉价底物合成莰烯；催化反应条件温和，产率高，并且不会产生有害副产品，实现了绿色、可持续的莰烯合成过程。本发明的酶催化法不仅提高了莰烯的产量，还降低了生产成本和环境影响。

2、本发明提供了一种催化合成莰烯的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明提供了一种催化合成莰烯的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明提供了所述的蛋白的制备方法，包括以下步骤：

5、1)将所述的基因克隆连接到初始载体中获得重组载体；

6、2)将所述重组载体转入初始菌株中获得重组菌株；

7、3)培养所述重组菌株获得菌体细胞；

8、4)破碎所述菌体细胞获得细胞裂解液，纯化获得目标蛋白。

9、优选的，所述初始载体为pcold载体。

10、本发明提供了一种生产莰烯的方法，包括以下步骤：

11、将底物、反应液和所述的蛋白混合孵育，终止反应后，添加小牛肠道碱性磷酸酶进行产物的去磷酸化，获得莰烯。

12、优选的，所述混合孵育的温度为25～35℃，所述混合孵育的时间为10～20min。

13、优选的，所述底物为香叶基焦磷酸，所述底物在反应体系中的浓度为0.5～5mm；所述蛋白在反应体系中的浓度为0.5～10mg/ml。

14、优选的，所述反应液包括tris-hcl、mgcl2、dtt、pmsf。

15、优选的，所述小牛肠道碱性磷酸酶的体积为反应体系体积的1～2％；所述去磷酸化的温度为36～38℃，所述去磷酸化的时间为50～70min。

16、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的催化合成莰烯的基因、生物酶能够催化廉价底物合成莰烯；催化反应条件温和，产率高，并且不会产生有害副产品，实现了绿色、可持续的莰烯合成过程。本发明的酶催化法不仅提高了莰烯的产量，还降低了生产成本和环境影响。根据实施例记载本发明提供的生物酶催化合成莰烯的产量达到23.8mg/l。

技术特征：

1.一种催化合成莰烯的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.一种催化合成莰烯的生物酶，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.权利要求2所述的生物酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述初始载体为pcold载体。

5.一种生产莰烯的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合孵育的温度为25～35℃，所述混合孵育的时间为10～20min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述底物为香叶基焦磷酸gpp，所述底物在反应体系中的浓度为0.5～5mm；所述蛋白在反应体系中的浓度为0.5～10mg/ml。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反应液包括tris-hcl、mgcl2、二硫苏糖醇dtt、苯甲基磺酰氟pmsf。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述小牛肠道碱性磷酸酶的体积为反应体系体积的1～2％；所述去磷酸化的温度为36～38℃，所述去磷酸化的时间为50～70min。

技术总结
本发明提供了一种催化合成莰烯的基因、生物酶及其在生产莰烯中的应用，属于生物酶催化技术领域，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；本发明提供的生产莰烯的方法，包括以下步骤：将底物、反应液和所述的蛋白混合孵育，终止反应后，添加小牛肠道碱性磷酸酶进行产物的去磷酸化，获得莰烯。所述生物酶能够实现高效催化生产莰烯，催化反应条件温和，产率高，并且不会产生有害副产品，实现了绿色、可持续的莰烯合成过程。

技术研发人员：陈贤情,王筱,黄利辉
受保护的技术使用者：嘉兴欣贝莱生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/5