hsa_circ_0017469在制备结直肠癌早筛及预后评估的产品中的应用

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及hsa_circ_0017469在制备结直肠癌早筛及预后评估的产品中的应用。

背景技术：

1、近年来，我国结直肠癌(colorectal cancer，crc)的发病率呈明显上升趋势，我国人口只占全球总人口的17％，但crc患者却占全球的31％，且还在以年均4％～5％的速度增长。结直肠癌是一种最能从筛查中获益的癌症，积极开展二级预防-大肠癌筛查对大肠癌的防治起重要作用。而对已经确诊大肠癌患者而言，个体化治疗是未来三级预防重点发展方向。大肠癌传统筛查方法是肠镜检查和粪便潜血检测。结肠镜检是临床诊断大肠癌的金标准，但属于侵入式检查，患者依从性差。粪便隐血试验是目前广泛应用的筛查方法，安全无创，受检者依从性较好，但检测灵敏度低，特异性差，易造成误诊。通过对血液中的肿瘤标志物进行筛查，常见的肿瘤标志物有癌胚抗原、ca125及ca199等，该指标受到机体炎症、应激等因素影响，无明显特异性。另一方面，crc的治疗手段包括根治性手术切除、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等，其中根治性手术切除是最有效的方法，但术后局部复发(60％～80％crc患者在术后2年内复发)、远处转移仍是当前面临的难题。因此，术后采取有效措施，及时评估并预测肿瘤的复发和转移尤为重要。结合肿瘤分期和各种临床病理特征可对crc患者的预后进行评估，但具有相同肿瘤分期及相似临床病理特征患者的预后仍存在显著差异，因此传统分期分级尚不能准确地判断病人的预后。目前，基于分子标志物特征指导下的crc精准治疗在临床中发挥越来越重要的作用。积极探索和发现与复发转移或治疗疗效评估相关的crc新型分子标志物不仅可以预测复发转移和评估治疗效果，还可以针对靶点进行分子靶向干预，大幅度提高患者的预后。

2、国内外crc相关共识、指南均强调：分子标志物的具体分型是影响转移性crc(metastatic crc，mcrc)治疗决策的重要因素，并一致推荐ras、braf、mmr/msi等作为常规分子标志物检测，以指导治疗和判断预后。但在crc已经无法作为单一疾病进行统一处理的精准医疗时代，分子标志物检测率在crc患者中仅为20％～30％，尤其在二、三线城市或医疗水平欠发达地区的检测率更低，在很大程度上影响crc患者的诊断和个体化治疗方案的选择。究其原因，一方面是目前可作为crc分子标志物的种类有限，另一方面也存在分子标志物检测周期长、价格贵等实际问题。

3、环状rna(circrna)是一种广泛存在的特殊的稳定rna分子，可以参与调控哺乳动物的基因表达，并与包括癌症在内的多种疾病相关。与传统的线性rna(linear rna，含5’和3’末端)不同，circrna分子呈封闭环状结构，不受rna外切酶影响，表达更稳定，不易降解。近年来，大量研究表明circrna与生物的生长发育、胁迫应答、疾病发生和发展等方面密切相关，并预测其在疾病诊断标记物等方面具有应用前景。环状rna在生物体细胞内极其稳定，是治疗人类疾病的热门靶点。其应用潜力非常大，为生物医药领域开拓了全新的思路。功能较明确的环状rna既可以作为某些疾病诊断的生物标志物，也可以作为某些重要疾病，尤其是免疫性疾病和癌症的治疗性靶点，广泛应用于感染性疾病、罕见病、血液病、肿瘤的治疗，兼具研究和应用价值。许多circrna已被鉴定为癌基因或肿瘤抑制因子，介导crc的发生、转移和化疗耐药。组织或外泌体中的circrna可在crc的临床实践中作为诊断和预后的生物标志物和潜在的治疗靶点。本发明提供一种与crc相关的circrna，可用于crc早筛及预后评估。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了hsa_circ_0017469在制备结直肠癌早筛及预后评估的产品中的应用，并提供了检测hsa_circ_0017469的试剂盒、方法和结直肠癌早筛及预后评估的产品。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一方面是提供检测hsa_circ_0017469的试剂在制备结直肠癌早筛或预后评估的产品中的应用，该产品包括检测hsa_circ_0017469的试剂。

4、进一步地，上述检测hsa_circ_0017469的试剂包括qrt-pcr检测用试剂、northernblot检测用试剂、液滴数字pcr检测用试剂、crispr/cas13a-rpa检测用试剂、高通量测序技术检测用试剂、核酸杂交技术检测用试剂、基因芯片技术检测用试剂中的一种或多种。

5、进一步地，上述qrt-pcr检测用试剂包括序列为seq id no.1～2的引物。

6、进一步地，上述crispr/cas13a-rpa检测用试剂包括序列为seq id no.5～6的引物和序列为seq id no.7的crrna。

7、进一步地，上述产品还包括检测cea的试剂。

8、本发明的第二方面是提供一种基于crispr/cas13a-rpa技术可视化检测hsa_circ_0017469的方法，采用的引物的序列为seq id no.5～6，采用的crrna为seq id no.7，反应完成后，置蓝光中观察。

9、进一步地，采用的反应体系包括ntp、crrna、cas 13a、rnase抑制剂、t7 rna聚合酶、引物、ssrnareporter、dna模板、mgoac、t4 uvsx重组酶、ssb和链置换dna聚合酶；优选包括如下含量的组分：2μl t4 uvsx(1mm)、3μl ssb(0.5mm)、2μlbsu(0.5mm)、3μlntp(1mm)、2μl crrna(40nm)、1μl正向引物(10μm)、1μl反向引物(10μm)、2μl ssrnareporter(80nm)、1μl模板、4μl cas13a(80nm)、1μlrnase抑制剂(40u)、1μlt7 rna聚合酶(30u)和2μlmgoac(0.1mm)。

10、进一步地，采用的反应程序为37℃15min。

11、本发明的第三方面是提供一种结直肠癌早筛或预后评估的系统，其包括：

12、检测hsa_circ_0017469表达量的模块；

13、数据处理模块，接收上述检测hsa_circ_0017469表达量的模块发送的患者hsa_circ_0017469的相对表达量数值，并与判断阈值进行比较；和结论输出模块，被配置为接收由上述数据处理模块发送的比较结果，并根据预定判定条件对比较结果进行判定；确定患者是否为结直肠癌患者或评价结直肠癌患者的预后。

14、进一步地，上述检测hsa_circ_0017469表达量的模块是基于qrt-pcr、northernblot、液滴数字pcr、crispr/cas13a-rpa、高通量测序技术、核酸杂交技术、基因芯片技术中的一种或多种构建获得。

15、本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

16、本发明采用arraystar circrna芯片对crc癌和癌旁组织的circrna进行筛选、鉴定，并进一步扩大组织样本量及临床血浆样本进行验证，证明了hsa_circ_0017469在crc患者癌组织中表达显著上升，可用于结直肠癌筛查及术后预后风险评估，并研制出可视化检测以及实时定量pcr检测hsa_circ_0017469的方法和产品，对结直肠癌筛查及术后预后风险评估提供了手段。