利用单碱基基因编辑技术突变OsWaxy基因改良水稻直链淀粉含量的方法与流程

本发明涉及基因编辑，具体地说，涉及一种利用单碱基基因编辑技术突变oswaxy基因改良水稻直链淀粉含量的方法。

背景技术：

1、随着人民群众生活水平的日益提高，对大米的消费逐渐转向优质化和专业化。目前，行业内公认的影响大米食味品质的最重要因素为直链淀粉含量，它与米饭质地的硬度、凝聚性和粘度等特性密切相关。在优质化方面，在ny/t593-2013食用稻品质定级指标中，籼稻和粳稻的一级米都要求直链淀粉含量在13％-18％之间，籼稻二级米要求在13％-20％，而三级米则在13％-22％之间。因此，直链淀粉含量是国家评价优质食用稻的重要关键性指标。与之对应的，保证直链淀粉的含量在13％-20％之间也是水稻优质化育种方向的重要目标。而随着大米消费专业化的发展，对大米直链淀粉含量的需求更加多样化，如专门用于做米粉的大米，或专门供糖尿病患者或高危人群食用的高抗性淀粉大米，甚至是南北方人民口感的差异，都要求在水稻育种中，能够快速精准调整直链淀粉含量，开发能够调整不同直链淀粉含量的生物技术。因此，开发精准调整直链淀粉含量的生物技术手段具有重要的商业价值。

2、oswaxy基因位于第6染色体的短臂，早在1990年就已被克隆，是决定直链淀粉合成的关键酶(wang et al.,1990)。过表达或降低oswaxy基因表达将导致贮藏器官中oswaxy基因酶活和直链淀粉含量明显上升或下降。通过突变体实验也发现，缺失oswaxy基因将获得直链淀粉缺失糯稻。oswaxy基因表达调控的机制目前还不完全清楚。除基因结构发生改变，影响其表达和蛋白功能外，可能受多个水平、多种因子的协同调控。oswaxy基因在自然界存在多种等位基因，在非糯品种中，oswaxy基因分化为oswaxya和oswaxyb两种等位基因，其中，野生稻全为oswaxya，籼稻以oswaxya为主，直链淀粉含量较高；粳稻基本为oswaxyb，直链淀粉含量较低。序列分析表明，与oswaxya相比，oswaxyb的第1内含子5'端剪切处发生由gt→tt的突变，导致第1内含子剪接效率降低及剪接不正常，从而使其转录本含量降低(hirano etal.,1998；isshiki et al.,1998)。此外，oswaxy基因在栽培水稻品种中存在多个等位基因，不同等位基因可能造成该基因表达值或酶活有显著差异，从而导致栽培水稻各个品种中直链淀粉含量差异很大。wxin突变点位于第6外显子第62位碱基由a突变为c，导致编码的酪氨酸突变为丝氨酸，wxin中该位点的突变可能改变了基因酶活，使得含有该等位基因品种直链淀粉含量降低。wxmq编码区域有两个位置发生突变，分别导致了第4外显子编码的第158位氨基酸由精氨酸突变为组氨酸，,5外显子编码的第191位氨基酸由酪氨酸突变为组氨酸，这两处突变显著降低了该品种中直链淀粉含量。可见，无论是人工突变还是自然突变产生的基因突变，oswaxy基因编码区的点突变有可能使基因活性降低或基因表达值变化、从而影响直链淀粉的合成。

3、基因编辑技术自诞生以来就成为生命科学领域的有力工具，最新一代的crispr/cas9由于其高效性和便捷性逐渐成为科研人员关注的焦点，在crispr/cas9系统中，向导rna(guide rna,grna)引导cas9蛋白在基因组的靶向位点进行精准切割造成dna双链断裂(double strand break,dsb)，宿主细胞利用自身的非同源末端连接(nonhomologous end-joining,nhej)或基于同源重组(homologous end recombination repair,hdr)进行修复。在研究基因功能时，通常会用到基因敲除(knock out)、敲入(knock in)、碱基置换(basesubstitution)等，在作物育种中，很多突变是单个核苷酸或者单个氨基酸突变造成的，因此相较于基因敲除和敲入，基于单碱基水平的精准修饰更具发展前景。2017年，david liu团队经过7轮的蛋白质分子进化与改造，突破性地开发出腺嘌呤碱基编辑器(adenine baseeditors，abes)。通过融合表达野生型以及突变型的腺苷脱氨酶tada和ncas9组成abe，abe通过sgrna的引导在靶向位置将腺嘌呤脱氨变成肌苷(inosine,i)，随后通过dna复制，dna聚合酶将i识别为g，从而实现非常高效的腺嘌呤到鸟嘌呤的转换(gaudelli et al.,2017)。在oswaxy基因功能研究过程中，除了模仿自然界中已知的变异外，利用单碱基基因编辑技术能够在基因编码区创制新的点突变，这些点突变位点大多数在自然界中不存在，因此，单碱基编辑技术能够创制大量的oswaxy基因的新等位基因，研究这些新等位基因的功能，不仅是解析稻米品质变异的重要途径，更是稻米品质改良的重要基础。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种利用单碱基基因编辑技术突变oswaxy基因改良水稻直链淀粉含量的方法。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种靶向oswaxy基因的单碱基基因编辑载体，所述载体包含腺嘌呤碱基编辑器和靶向oswaxy基因的特异性核酸酶。

3、本发明中，oswaxy基因编码的蛋白在ncbi上的参考序列编号为xp_015644490.1。

4、所述特异性核酸酶可选自crispr/cas9、crispr/cas12a、talen、meganuclease(归巢核酸内切酶)和zfn等中的任一种。

5、优选地，所述载体是基于crispr/cas9的腺嘌呤碱基编辑载体(abes)(图1)，所述载体至少包含第一表达盒和第二表达盒；

6、其中，abes载体的第一表达盒为ectada-ectada*7.10-ncas9表达盒；所述第一表达盒包含的核酸构建体ectada-ectada*7.10-ncas9的序列如seq id no:3所示。

7、第二表达盒为sgrna表达盒，且sgrna作用位点位于oswaxy基因的外显子上。

8、更优选地，sgrna作用位点的dna序列选自如下①～⑤中的任一个：

9、①5′-catcgaccatccgtcattcc-3′；

10、②5′-atccacaacatctcctacca-3′；

11、③5′-tcggcaggctggaggaacag-3′；

12、④5′-gacactggagttgattacaa-3′；

13、⑤5′-tcgtcaacggcatggacgtc-3′。

14、优选地，所述第一表达盒由甘蔗ubi4启动子驱动，所述第二表达盒由水稻u3启动子驱动。

15、第二方面，本发明提供所述靶向oswaxy基因的单碱基基因编辑载体在水稻育种和品种改良中的应用。

16、其中，育种目的为改良水稻直链淀粉含量。

17、第三方面，本发明提供利用单碱基基因编辑技术突变oswaxy基因改良水稻直链淀粉含量的方法，所述方法包括将所述靶向oswaxy基因的单碱基基因编辑载体导入水稻中。

18、优选地，所述水稻为籼稻。

19、第四方面，本发明提供oswaxy蛋白突变体，所述突变体包含如下a～f突变中的任一种：

20、a.oswaxy蛋白第166位氨基酸由d到g的突变；

21、b.oswaxy蛋白第167位氨基酸由h到r的突变；

22、c.oswaxy蛋白第265位氨基酸由n到s的突变；

23、d.oswaxy蛋白第191位氨基酸由y到h的突变；

24、e.oswaxy蛋白第353位氨基酸由n到d的突变；

25、f.oswaxy蛋白第353位氨基酸由n到s的突变。

26、本发明中，oswaxy蛋白在ncbi上的参考序列编号为xp_015644490.1。

27、第五方面，本发明提供一种改良水稻直链淀粉含量的方法，所述方法包括：利用基因工程手段，在水稻基因组中引入突变，使其编码的oswaxy蛋白包含d166g、h167r、y191h、n265s、n353d或n353s突变位点。

28、本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

29、本发明提供一种通过修饰水稻oswaxy基因改良水稻直链淀粉含量的方法，通过对所述水稻oswaxy基因进行腺嘌呤碱基编辑从而改良直链淀粉含量，包括如下步骤：

30、(1)根据oswaxy基因编码区设计靶位点；

31、(2)构建腺嘌呤碱基转化工具(adenine base editors，abes)载体，将拟改良水稻品种的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将单碱基编辑载体导入愈伤组织细胞，并再生成水稻植株；

32、(3)对oswaxy基因编辑体的基因型检测和分析，选取单个或多个氨基酸发生改变的编辑体进行性状分析，考察直链淀粉含量。

33、所述方法是基于特异性核酸酶的基因编辑技术，序列特异性核酸酶选自crispr/cas9、crispr/cas12a、talen、meganuclease和zfn。

34、其中，水稻oswaxy基因由seq id no:1所示的核苷酸序列组成，或编码seq id no:2所示的氨基酸序列，或将seq id no:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。

35、本发明通过单碱基编辑改良水稻直链淀粉含量的方法，grna靶位点的选择。靶位点选在水稻oswaxy基因的编码区内。

36、oswaxy基因修饰结果为，该基因编码的蛋白质在编辑靶位点区域发生一个或多个氨基酸突变。

37、本发明还提供所述方法在创制水稻改良种质资源中的应用。

38、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

39、本发明提供的利用单碱基基因编辑技术突变oswaxy基因改良水稻直链淀粉含量的方法。通过构建腺嘌呤碱基编辑器abes载体靶向oswaxy基因特定序列，以水稻为转化材料，使oswaxy蛋白的单个或多个氨基酸突变，突变体的直链淀粉含量测定结果显示，oswaxy蛋白单个或多个氨基酸突变能够导致突变体内胚乳直链淀粉含量发生显著改变，说明通过单碱基基因编辑技术改变oswaxy蛋白的单个或多个氨基酸能够显著改良水稻的直链淀粉含量。本发明提供的非转基因纯合oswaxy基因突变体将成为非常有价值的种质资源，可以利用它们改良水稻品种的直链淀粉含量，本发明为利用单碱基基因编辑技术快速改良水稻品种的直链淀粉含量提供有效策略。