一种小球藻凝胶保存方法

本发明涉及微藻保种，尤其涉及一种小球藻凝胶保存方法。

背景技术：

1、由于人类活动，二氧化碳（co2）占温室气体排放量的68%。每年大约向地球大气排放33.4gt二氧化碳，其中约40%来自化石燃料发电厂。开发能够以低能耗和低成本进行的二氧化碳捕获、利用和储存（ccus）技术是极其重要的。

2、与co2的化学吸收和地质封存相比，微藻生物捕获co2被认为是一种很有前途的减少co2排放的新方法。

3、微藻通过光反应将太阳能转化为活性化学能，并通过暗反应将活性化学能和co2转化为有机物的稳定化学能，而不会产生二次污染。微藻介导的co2捕获由于其优势，如比陆地植物更高的光合效率（10–50倍）、微藻的生命周期短（4–10天）、强大的环境适应性、使用海水和废水进行培养的可能性，避免与作物竞争。碳占微藻生物量的50%，1千克生物量可以固定1.83千克二氧化碳。此外，微藻可以以二氧化碳为食，并生产用于增值产品或生物燃料的生物质。

4、根据目前的研究可以发现，用于固碳的藻种大部分都是小球藻跟栅藻。本研究主要是对小球藻进行保种。小球藻（ chlorellavulgaris）绿藻纲，小球藻科。单细胞藻，常单生，也有多细胞聚集。细胞形状为球形、椭圆形，内部有一个周生、杯状或片状的色素体。无性繁殖，每个细胞可以产生2、4、8或16个似亲孢子，成熟时母细胞破裂，孢子逸出，长大后即为新个体。世界各地均有分布，多生活于较小浅水，也有海产种类。天然条件下个体较少，人工培养大量繁殖。细胞内的蛋白质、脂肪和碳水化合物含量都很高，又有多种维生素，可食用和作为饵料。

5、而将微藻用于固碳，就需要对微藻进行保种，使微藻在运输的过程中能够保持足够的活性，并且在活化之后能够表现出较好的固碳效果。目前主要的微藻保存技术有：继代法保存技术、固定化保存技术、超低温保存技术、浓缩低温保存技术、真空冷冻干燥保存技术。相培养基上，在适宜的光照和温度下培养，待藻种生长状态良好后，将其移至常温或低温及弱光下保存。一般一次转接藻种可保存几个月到一年，然后进行再次转接，该保存方法可适用于一切藻类。继代法是实验室中保存藻种的常见方法，简单易行，设备简单，但工作琐碎，耗时较长，需要频繁的转接藻种，易造成藻种的染菌或使藻种老化，丧失活性。固定化保存技术是一种最接近藻种原始状态下的培养方法，是指将游离细胞包埋在多糖或多聚化合物形成的网状结构中，在无菌环境下培养，因为固定载体的存在，藻种的代谢过程受到束缚，从而减缓了细胞生长分裂的速度，导致微藻生长速度减缓，其固定化时间随微藻的种类而变化。微藻的固定化技术包括吸附法、包埋法和交联法三种，分别通过不同的作用力和作用方式与微藻结合，其中包埋法因使用方法简单，基本不会影响微藻藻种的生物活性，颗粒强度高等优点，是当下应用最为广泛的微藻固定方法。固定化保存技术于多数藻种是适用的，且保存时间相对较长，可在常温或中低温下实现对藻种的中期保存，且活化复苏很快，设备简单，但固定化步骤较多，对操作要求高，在培养后阶段，多数藻种容易从胶珠中溢出，有的胶珠甚至会融解。且不同藻种对某一固定化保种技术会有不同的适应状态，原因和机制都不明确，尚待深入研究，这是以后该技术发展的难点之一。

6、超低温保存是指在低共熔点(-135~139°c)以下的温度保存材料，通常使用液氮(-196°c)作为冷媒，此时生物体的代谢及生长过程几乎完全终止，但处于可逆成活的状态，是一种能够长期保持生物遗传稳定性的技术，也是目前保存活体生物材料最为有效的方法。超低温保存技术是当前唯一不需要继代培养长期保存微藻类资源的方法，其研究技术也在不断创新和发展中取得了一些进展，但仍存在着缺少普适的各类微藻保存冷冻程序、缺少能进行超低温长期保存的微藻保存中心等问题。

7、微藻的浓缩低温保存技术是用物理或化学的方法将培养的藻液浓缩为藻泥或藻膏，再低温保存；该方法多用于海洋微藻。浓缩低温保种技术可简单高效的保存藻种，但保存时间较短，也存在着一些尚待考察的问题，如每一种藻类最适的化学浓缩剂及剂量不能确定，不同化学浓缩剂和冷冻保护剂的毒性除去方法需成本低、效率高，但相关技术对细胞作用的细节需要更深层次的研究。

8、真空冷冻干燥保技术是将藻种在极低的温度下(-70°c左右)快速冻结，然后用真空技术将微藻中的水分抽干，让藻种的新陈代谢活动介乎高度静止状态。相对于普通直接干燥脱水和硅胶吸附脱水，真空冷冻干燥保存最大限度的避免了对细胞的直接伤害，并使细胞在较温和的条件下处于干燥和缺氧状态，从而使微生物的代谢活动处于休眠状态，生长繁殖受到抑制。真空冷冻干燥保存技术被公认为是迄今最佳的藻种保存方法。该方法主要集中用在蓝藻和绿藻中。用脱脂乳、蜂蜜等做保护剂，将藻液置于安瓿管中，冷冻、干燥并抽真空，火焰熔封，放置低温避光处保存，可保存十几年。冷冻干燥保存法的优点保存期内可防止其他杂菌污染，运输方便，解冻后微藻能保持活性，适合在工业化生产中使用，有广泛的应用领域；其缺点是使用方式过于复杂、对仪器的性能要求高等。

9、可以很明显的看出，目前主要的几种微藻保存技术都有一些缺点且不适用于用于固碳微藻的藻种保存，所以需要开发一种新的微藻保种技术。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种小球藻凝胶保存方法，本方法操作简单，而且能够极大程度的维持小球藻的生物活性，使小球藻在活化之后能够快速扩培并进行固碳实验。

2、为了实现本发明的目的,本发明采用的技术方案为：

3、本发明公开了一种小球藻凝胶保存方法，包括以下步骤，

4、（1）培养：将小球藻藻种接种于tap培养基中摇床振荡培养，每天监测微藻藻细胞密度，将微藻培养至对数生长期，待用；

5、（2）制备凝胶：海藻酸钠的浓度为1%-5%，称取2g海藻酸钠溶于100ml水中，在100℃恒温水浴锅边加热边搅拌使其完全溶解，将其放于无菌生物柜使用紫外杀菌，冷却待用；

6、（3）制备小球藻凝胶：将步骤（2）中的凝胶加入到步骤（1）中，搅拌均匀，得到小球藻凝胶，将小球藻凝胶转移至密闭试管或者密封袋；

7、（4）保存：将密封好的小球藻凝胶放置于多种环境条件保存。

8、所述步骤（1）中，tap培养基的成分为2.42g/ltris（三羟甲基氨基甲烷）、0.375g/lnh4cl、0.05g/lcacl2·2h2o、0.10g/lmgso4·7h2o、0.0108g/lk2hpo4、0.0054g/lkh2po4、1ml/l冰乙酸、0.05g/ledta-na2、0.022g/lznso4·7h2o、0.0114g/lh3bo3、0.00506g/lmncl2·4h2o、0.00161g/lcocl2·6h2o、0.00157g/lcuso4·5h2o、0.00110g/l(nh4)6mo7o24·4h2o、0.00499g/lfeso4·7h2o，余量为无菌水，在121℃下灭菌20min。

9、所述步骤（1）中，培养光照周期为24:0h，温度为27-29℃。

10、所述步骤（1）中，培养期间主要水化学指标为：水温为20-25℃。

11、所述步骤（2）中，海藻酸钠的质量分数为0.2%。

12、所述步骤（4）中，小球藻凝胶置于20-25℃，无菌、充氧、弱光环境下保存。

13、本发明的有益效果在于：

14、（1）操作简便，无需特殊的仪器就能进行；（2）能够较大程度的保存微藻的活性，并且能够较快的活化微藻，将微藻用于固碳实验；（3）可在常温条件下贮藏和运输，避免低温能耗和运输不便。