一种去甲肾上腺素化学发光探针及其制备方法和应用

本发明属于医药，具体涉及一种去甲肾上腺素化学发光探针及其制备方法和用途。

背景技术：

1、去甲肾上腺素(norepinephrine，ne)是一种参与觉醒、注意、运动、学习、记忆以及应激等调控的神经递质，其功能障碍与帕金森病、阿尔茨海默病、抑郁症等疾病密切相关。它主要由脑干蓝斑核区(locus coeruleus,lc)的去甲肾上腺素能神经元合成和释放。在帕金森疾病(parkinson’sdisease，pd)病理进程中，出现黑质(substantia nigra)中多巴胺神经元凋亡，纹状体(striatum)中神经元间突触变性及运动障碍。此外，蓝斑核区去甲肾上腺素能神经元深度变性，导致ne释放减少。ne通过抑制小胶质细胞的活化，下调促炎基因的表达而保护神经元。小鼠脑内去甲肾上腺素能神经元的损伤，会加重炎症对多巴胺能神经元的损伤。此外，pd的许多运动障碍与ne耗竭存在紧密联系。去甲肾上腺素能神经元损伤的小鼠或多巴胺β羟化酶(ne合成酶)基因敲除的小鼠表现出严重的运动障碍。pd患者脑脊液中ne水平显著低于健康人，而且脑脊液ne水平较低的患者普遍患有认知功能障碍。这表明ne的水平失调参与了帕金森疾病的病理进程。具体机制尚未阐明。

2、在现有的去甲肾上腺素检测方法中，液相色谱法、电化学法、质谱法、毛细管电泳法及酶联免疫吸附法能够实现去甲肾上腺素高灵敏度检测，然而它们都需要破坏组织或细胞，在动物体内原位检测ne仍存在一定局限性。荧光探针法不仅具有良好的响应性和灵敏度，而且能够实现实时原位监测ne。荧光探针检测ne的响应机制包括儿茶酚基与苯硼酸酯化、β-羟乙胺结构的保护-脱保护、氨基与醛基缩合、氨基与吡喃鎓盐上碳碳双键的亲核加成。基于这一系列响应机制，开发出了一系列性能优良的小化学发光探针。尽管ne近红外荧光探针活体内成像方面取得了进展，但荧光探针的光漂白现象、背景干扰、组织穿透力弱等引起的误差问题仍然存在。因此，有必要开发一种信噪比高、灵敏度高、适合在体检测ne的化学发光探针。

3、化学发光是指在化学反应中产生光的现象，这种光是通过化学反应中的化学激发产生的。在反应中，某些物质被氧化激活后形成高能氧化中间体，将自身的能量分解或传递给附近的荧光团，并最终返回到基态，释放出光信号。与传统的荧光探针法相比，它不需要外部激发光，具有高信噪比、高灵敏度和低光损伤的优势，在活体成像中具有较好的应用前景。1,2-二氧杂环丁烷是目前应用最广泛的化学发光底物，它不需要活性氧的触发，便于进行修饰。但是该底物发射波长短，量子产率低，限制了其在活体成像中的应用。shabat课题组、lippert课题组、peng课题组通过在1,2-二氧杂环丁烷的苯环上引入氯原子及近红外发色团，提高了该类化合物的发光量子产率，并且使化学发光波长红移。这些发现极大地促进了化学发光探针进一步应用于活体成像。

技术实现思路

1、本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种去甲肾上腺素化学发光探针。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种去甲肾上腺素化学发光探针，它的化学结构如式(i)所示，

4、

5、一种去甲肾上腺素化学发光探针的制备方法，其合成路线如下：

6、

7、在一种优选的去甲肾上腺素化学发光探针的制备方法中，其反应步骤包括：将化合物1与原甲酸三甲酯通过亲核加成反应得到化合物1a，然后1a和tbs-cl通过亲核取代反应制得化合物1b，1b再与亚磷酸三甲酯通过arbuzov反应得到化合物1c，1c与2-金刚烷酮通过亲核加成反应得到化合物ld，1d通过四丁基氟化铵脱掉tbs保护基团得到le，le经氯化镁催化生成芳香醛类化合物1f，1f与2-(2-甲基-4h-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈通过克脑文盖尔缩合反应生成化合物1g，1g通过三光气与4-甲基苯硫酚缩合，在通o2状态下经亚甲基蓝催化生成式(i)化合物。

8、在一种优选方案中，将2-氯-3-羟基苯甲醛溶解于甲醇中，然后加入原甲酸三甲酯和四丁基三溴化铵反应得到化合物1a。

9、优选的，将2-氯-3-羟基苯甲醛(5g,32.05mmol)溶解于30ml甲醇中，然后加入原甲酸三甲酯(5.25ml,48.08mmol)和四丁基三溴化铵(0.77g,1.5mmol)，65℃回流反应2h，得到化合物1a。

10、在一种优选方案中，1a和tbs-cl通过亲核取代反应制得化合物1b。

11、优选的，将化合物1a(7.07g,34.89mmol)和咪唑(4.76g,69.92mmol)溶于40mlch2cl2中，之后加入叔丁基二甲基氯硅烷(6.29g,41.67mmol)，室温反应1h，得到化合物1b。

12、在一种优选方案中，1b与亚磷酸三甲酯通过arbuzov反应得到化合物1c。

13、优选的，将化合物1b(9.08g,28.67mmol)溶于50ml二氯甲烷，在冰水浴中搅拌冷却至0℃后，加入亚磷酸三甲酯(4.7ml,36.08mmol)，反应5min，再缓慢滴加入四氯化钛(3.95ml,35.94mmol)，在0℃的冰水浴中反应2h，得到化合物1c。

14、在一种优选方案中，1c与2-金刚烷酮通过亲核加成反应得到化合物ld。

15、优选的，将化合物1c(4.90g,12.43mmol)溶于25ml无水thf中，并将反应液冷却至-78℃，在氩气保护下，将lda(2.0m in thf,7ml)逐滴滴加至上述反应液中，可观察到溶液变成棕色，反应25min，之后将2-金刚烷酮(2.73g,18.17mmol)溶于20ml thf中，然后逐滴滴加至反应液中，继续在-78℃反应25min，将反应液升至室温反应1h，得到化合物1d。

16、在一种优选方案中，将化合物1d与四丁基氟化铵反应，得到化合物1e。

17、优选的，将化合物1d(2.32g,5.58mmol)溶于30ml thf中，之加入四丁基氟化铵(1.0m in thf,13.80ml)，室温反应1h，得到化合物1e。

18、在一种优选方案中，将化合物1e与mgcl2和三乙胺混合后加入多聚甲醛进行反应，得到化合物1f。

19、优选的，将化合物1e(500mg,1.64mmol)溶于4ml ch3cn中，顺序加入mgcl2(344mg,3.61mmol)、三乙胺(500μl,3.61mmol)、多聚甲醛(395mg,13.1mmol)后，将反应液回流10h，得到化合物1f。

20、在一种优选方案中，将化合物1f溶于乙腈中，然后加入哌啶与2-(2-甲基-4h-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈，在70～90℃反应，得到化合物1g。

21、优选的，将化合物1f(1.4g,1.4mmol)溶于10ml乙腈中，然后加入哌啶(616μl,6.24mmol)与2-(2-甲基-4h-苯并吡喃-4-亚基)丙二腈(1.06g,5.11mmol)，在80℃反应1h，得到化合物1g。

22、在一种优选方案中，将化合物1g通过三光气与4-甲基苯硫酚缩合，在通o2状态下经亚甲基蓝催化生成化合物(i)。

23、在一种优选方案中，本发明的去甲肾上腺素化学发光探针可以应用在定量检测去甲肾上腺素方面。

24、在一种优选方案中，本发明的去甲肾上腺素化学发光探针可以应用在细胞、小鼠中检测去甲肾上腺素的化学发光成像方面。

25、在一种优选方案中，本发明的去甲肾上腺素化学发光探针可以应用在制备诊断试剂方面，特别是在检测帕金森病、阿尔茨海默病或抑郁症相关神经系统疾病方面。

26、采用本发明的技术方案，优势如下:

27、1.本发明合成的探针cl-ne检测ne的选择性好，性质稳定，灵敏度高，检测限为139nm，与ne反应时可在6min内达到化学发光强度峰值，并且在1h内保持较高水平。

28、2.该探针实现了细胞生理水平、小鼠脑组织水平的ne检测，更重要的是，该探针实现了帕金森模型小鼠脑内ne的检测，初步提示帕金森模型小鼠脑内ne水平变化参与了帕金森的病理进程。