仙草品种鉴定的SSR分子标记引物、试剂盒及鉴定方法

本发明属于仙草鉴定，具体涉及仙草品种鉴定的ssr分子标记引物、试剂盒及鉴定方法。

背景技术：

1、仙草是一种唇形科仙草属一年生草本植物，又称为凉粉草；其作为传统的药食两用植物，含有丰富的多糖、黄酮和多酚等活性成分，具有清热解毒、润肺止咳、抗炎镇痛等药用价值。此外，仙草也是我国南方地区生产凉茶和凉粉的主要原料之一，经济价值极高。

2、不同仙草品种中的多糖、黄酮和多酚等含量不同，这些差异是影响相关产品生产的重要因素，所以选用优质的品种进行生产，才能更大程度体现出经济价值。然而，目前仙草种质资源的区分仍以外观形态为主，包括：直立型、半直立型、匍匐型等的茎秆类型，但这种方式很大程度依赖于经验，品种间的区分难度大。再者，仙草以野生资源为主，且由于种子少、易变异、出苗成活率低，生产上一般无选择性地进行无性繁殖，所以在长期栽培过程中造成了种质资源混杂退化。加之，市场上鲜见专业的仙草种苗繁育机构，导致仙草品种混杂退化现象加剧，不利于选育优质品种，更不利于仙草生产的经济发展。因此，寻找到一种科学、可靠、且高效鉴定、筛选优质的仙草品种的方法非常重要。值得一提的是，随着分子标记辅助育种技术的兴起和成熟，使得利用分子标记技术来鉴定仙草品种成为一种较稳定和高效的手段。

3、专利文献cn110484653a公开了ssr分子标记引物、仙草品种的鉴定方法及试剂盒，文献中提及的ssr分子标记引物用于扩增分子标记，仙草的分子标记选自ssr80位点、ssr82位点、ssr83位点、ssr100位点、ssr102位点和ssr106位点中的至少一种。但是上述位点只针对4种不同的已知仙草品种和两种未知仙草品种进行鉴定。

技术实现思路

1、本发明针对现有的仙草品种的鉴定方法过于传统且缺乏科学性，而提供一种能快速、准确客观鉴定仙草品种的ssr分子标记引物、试剂盒及鉴定方法。该ssr分子标记引物具有稳定可靠、多态性和通用性高的特点，可用于鉴定更多不同品种的仙草以及仙草属植物种质资源鉴定、指纹图谱构建、核心种质挖掘和遗传多样性分析等研究。

2、因此，本发明的第一个目的是提供仙草品种鉴定的ssr分子标记引物，所述ssr分子标记包括zk19位点、zk21及zk32位点中的至少一种，所述zk19位点的核苷酸序列包含以ataaa为重复单元的串联重复序列，所述zk21位点的核苷酸序列包含以tagtat为重复单元的串联重复序列，所述zk32位点的核苷酸序列包含以ttttg为重复单元的串联重复序列。

3、所述的ssr分子标记引物包括用于扩增zk19、zk21和zk32位点的至少一种引物，其中，

4、用于扩增zk19位点的引物序列为：

5、f：5’-ttgcatcttcatgtgcaattc-3’；

6、r：5’-cacaacaattcacctcgcaa-3’；

7、用于扩增zk21位点的引物序列为：

8、f：5’-gagaaactgcagcaaaaggc-3’；

9、r：5’-accatcatcatcagcagcag-3’；

10、用于扩增zk32位点的引物序列为：

11、f：5’-gcagaccataatgcttttgtga-3’；

12、r：5’-ccttagtggatttcatgggc-3’。

13、本发明的第二个目的是提供上述的ssr分子标记引物在制备鉴定仙草品种的试剂盒中的应用。

14、本发明的第三个目的是提供一种鉴定仙草品种的试剂盒，其包括上述的ssr分子标记引物。

15、优选的，所述的试剂盒还包括dna提取试剂、dna聚合酶预混液及电泳试剂中的至少一种。

16、本发明的第四个目的是提供上述的ssr分子标记引物或试剂盒在鉴定仙草品种中的应用。

17、本发明的第五个目的是提供上述的ssr分子标记引物或试剂盒在仙草属植物种质资源鉴定、指纹图谱构建、核心种质挖掘或遗传多样性分析中的应用。

18、本发明的第六个目的是提供一种仙草品种的鉴定方法，其包括以下步骤：

19、(1)提取待测仙草样品的基因组dna；

20、(2)以待测仙草样品的基因组dna为模板，采用上述的ssr分子标记引物进行pcr扩增，得到扩增产物；

21、(3)将扩增产物进行检测，根据检测结果来鉴定仙草的品种。

22、优选的，所述的检测包括毛细管荧光电泳或聚丙烯酰氨凝胶电泳。

23、优选的，所述的pcr扩增的反应体系为：12.5μl green taq mix(from vazymebiotechco.,ltd)、1.25μl 10μm正向引物、1.25μl 10μm反向引物、2μl 200ng·μl-1模板dna，无菌ddh2o补齐至25μl。

24、优选的，所述的pcr扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，54℃～55℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃后延伸5min。

25、本发明的有益效果是：

26、与现有技术相比，采用本发明提供的ssr分子标记引物能够同步鉴定更多不同品种的仙草，包括梅州品种、亲本品种、仲仙一号、露丰一号、增城二号、杂交品种、仙草d、仙草o、仙草q和仙草t的10个品种，该ssr分子标记引物具有稳定可靠、多态性和通用性高的特点，可用于鉴定更多不同品种的仙草以及仙草属植物种质资源鉴定、指纹图谱构建、核心种质挖掘和遗传多样性分析等研究。

技术特征：

1.仙草品种鉴定的ssr分子标记引物，其特征在于，所述的ssr分子标记引物包括用于扩增zk19、zk21和zk32位点的至少一种引物，其中用于扩增zk19位点的引物序列为：

2.权利要求1所述的ssr分子标记引物在制备鉴定仙草品种的试剂盒中的应用。

3.一种鉴定仙草品种的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的ssr分子标记引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括dna提取试剂、dna聚合酶预混液及电泳试剂中的至少一种。

5.权利要求1所述的ssr分子标记引物或权利要求3所述的试剂盒在鉴定仙草品种中的应用。

6.权利要求1所述的ssr分子标记引物或权利要求3所述的试剂盒在仙草属植物种质资源鉴定、指纹图谱构建、核心种质挖掘或遗传多样性分析中的应用。

7.一种仙草品种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的仙草品种的鉴定方法，其特征在于，所述的检测包括毛细管荧光电泳或聚丙烯酰氨凝胶电泳。

9.根据权利要求7所述的仙草品种的鉴定方法，其特征在于，所述的pcr扩增的反应体系为：12.5μl green taq mix、1.25μl 10μm正向引物、1.25μl 10μm反向引物、2μl200ng·μl-1模板dna，无菌ddh2o补齐至25μl。

10.根据权利要求7所述的仙草品种的鉴定方法，其特征在于，所述的pcr扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，54℃～55℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃后延伸5min。

技术总结
本发明公开了仙草品种鉴定的SSR分子标记引物、试剂盒及鉴定方法。所述的SSR分子标记引物包括用于扩增ZK19、ZK21和ZK32位点的至少一种引物。其中扩增ZK19位点的引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示，扩增ZK21位点的引物序列如SEQ ID NO.3‑4所示，扩增ZK32位点的引物序列如SEQ ID NO.5‑6所示。使用以上SSR分子标记引物可以快速、准确地鉴定出十种不同的仙草品种，本发明为仙草属植物种质资源鉴定、指纹图谱构建、核心种质挖掘和遗传多样性分析等研究提供技术支持。

技术研发人员：齐永文,黄沥锋,樊丽娜,赖瑞强,薛晓明,胡元强,李煜聪
受保护的技术使用者：仲恺农业工程学院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6