具有二肽基肽酶-4抑制活性的小分子肽及其应用

本发明涉及活性小分子肽，具体涉及具有二肽基肽酶-4抑制活性的小分子肽及其应用。

背景技术：

1、糖尿病是一类在世界范围内广泛存在的代谢性疾病。近年来，糖尿病的发病率在逐年上升。其中2型糖尿病(t2d)占90％以上。与1型糖尿病患者胰岛素的绝对缺乏不同，2型糖尿病表现为胰岛素的相对缺乏，即外周组织对胰岛素作用不敏感，并产生糖、脂、蛋白质代谢紊乱，后期会引发严重的糖尿病并发症。目前临床常用的口服降血糖药主要包括：胰岛素分泌促进剂(磺脲类)、胰岛素增敏剂(双胍类)和碳水化合物调节剂(α-糖苷酶抑制剂)。然而这些药物随着用药时间的延续药效逐渐下降，且伴有低血糖、胃肠道功能紊乱、肝损伤等诸多副作用。

2、二肽基肽酶-4(dpp-4)是一种丝氨酸蛋白酶，能水解肽链n端的xaa-pro或xaa-ala结构。dpp-4在人体全身各部位都有表达，该酶在炎症反应和胰岛素调节中发挥了重要作用。人体内源性的胰高血糖素样肽-1(glp-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素激素(gip)能够促进机体的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，在人体血糖平衡调节中具有重要作用。然而，glp-1和gip氨基末端的两个氨基酸会被dpp-4迅速切除从而丧失其调节血糖的生理功能。dpp-4抑制剂通过抑制dpp-4而减少glp-1在体内的失活，使内源性glp-1的水平升高。glp-1通过血糖依赖性刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素而发挥降低血糖的作用。此外，dpp-4抑制剂还可以降低心血管不良事件的发病风险，降低总胆固醇、甘油三酯水平，在动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝等疾病中也起到一定的治疗作用，其也是研究dpp-4在免疫反应、缺血再灌注损伤、心力衰竭、癌症等方面功能的有力工具。

3、单独使用dpp-4抑制剂不增加低血糖发生的风险，也不增加体重，但dpp-4抑制剂如西格列汀、维格列汀等存在肝肾损伤、胃肠道紊乱等副作用，因此，研究开发一种来源广、价格低且安全无毒副作用的糖尿病药物具有非常大的前景。

4、活性小分子肽是对生物机体的生命活动有益或是具有生理作用的肽类化合物，其口服吸收利用度高，且代谢产物氨基酸基本不具备毒性，所以安全性高，是极具发展前景的功能因子。因此，找到一种简单易制备且具有dpp-4抑制活性的小分子肽用于糖尿病的防治有很大的意义。

技术实现思路

1、发明目的

2、本发明的目的在于公开具有抑制dpp-4活性的肽，所述抑制寡肽包含氨基酸序列iavp及其功能性变体，具有良好的dpp-4抑制活性，可用于治疗和/或预防dpp-4介导的疾病，例如糖尿病、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化等疾病。

3、技术方案：

4、一种dpp-4抑制寡肽，其特征在于，所述抑制寡肽由氨基酸序列iavp及其功能性变体组成，在一些实施方案中，所述变体为iavp的c端添加下述任一序列后产生的变体：g、ge、gev或geva。

5、在一些实施方案中，所述变体为iavp的c端添加的ge、gev或geva部分发生一处或多处保守型取代后产生的变体。

6、在一些实施方案中，保守型取代选自d和e之间的取代以及v、l和i之间的取代。

7、在一些实施方案中，所述变体为iavp的c端添加下述任一序列后产生的变体：g、gd、ge、gdv、gev、gdl、gel、gdi、gei、gdva、geva、gdla、gela、gdia或geia。

8、所述的dpp-4抑制寡肽，其特征在于，所述的抑制寡肽为iavp、iavpge或iavpgeva

9、所述的dpp-4抑制寡肽可用于治疗或预防dpp-4介导的疾病药物中的应用。

10、所述的应用，dpp-4介导的疾病为糖尿病、糖尿病并发症、或肥胖。

11、一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1或2所述的所述抑制寡肽、一种或多种药学上可接受的辅料。

12、所述的药物组合物，其特征在于其剂型包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、丸剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

13、本发明还提供了所述寡肽在制备缓解糖尿病症状产品、降脂产品、抗氧化产品中的应用。

14、所述药品含有上述dpp-4抑制寡肽、一种或多种药学上可接受的辅料。

15、所述药品的剂型包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、丸剂、口服液。

16、所述药学上可接受的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂或稳定剂等。

17、所述药品的给药方式包括皮下注射、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、口服给药。

18、本发明实验方法：

19、本发明利用autodock vina软件，对潜在的抑制寡肽片段及其通过添加和/或取代部分氨基酸序列后产生的变体与dpp-4活性位点进行分子对接，并对其进行理化性质、admet等性质的预测。之后，通过固相合成法合成出寡肽iavp以及其具有代表性的两个功能性变体iavpge和iavpgeva，验证其体外dpp-4抑制活性，并测定其抑制类型。接着，对使用dpp-4抑制寡肽灌胃给药后的icr小鼠进行口服葡萄糖耐量试验，验证其体内生物学活性。最后，使用一种功能性变体iavpge干预高脂饮食诱导的2型糖尿病c57bl/6j小鼠，验证其对糖尿病的防治作用。

20、有益效果：

21、1)本发明通过计算机辅助技术进行定向虚拟筛选，利用分子对接、在线数据库预测等方法，筛选出具有降血糖作用的抑制寡肽(iavp、iavpge或iavpgeva)；其中寡肽iavpge对2型糖尿病小鼠的生理指标具有显著改善，其高剂量组与西格列汀降糖效果相当，且比西格列汀相比具有更好的降脂效果，寡肽iavpge无西格列汀的副作用，更加安全，具体如下：

22、寡肽iavpge对2型糖尿病小鼠，在给药结束后已处于正常的空腹血糖范围。寡肽iavpge与西格列汀效果相似，能有效降低糖化血红蛋白的含量。寡肽iavpge和西格列汀均能促进胰岛素分泌，且对胰岛素抵抗有较好的改善。寡肽iavpge与西格列汀均能提高glp-1水平，从而发挥促进胰岛素分泌、调节血糖平衡的有益作用；寡肽iavpge能够降低肥胖导致的肝指数、总胆固醇以及甘油三酯的升高，且相较于西格列汀具有更好的降脂效果。寡肽iavpge在长期给药后无肝毒性，且能有效减少肝细胞损坏，预防肝损伤。该实验表明寡肽iavpge几乎无溶血活性，安全性高。使用寡肽iavpge干预2型糖尿病小鼠4周后，小鼠的主要器官组织并未在原有基础上产生病变，体内外实验证明，寡肽iavpge的安全性高，几乎无毒副作用。

23、2)本发明通过探究肽与dpp-4分子对接构象中的结合方式以及相互作用类型，为其变体存在相应功能提供了依据。最后选取了具有潜在抑制活性的肽段及其代表性的变体，通过体内外实验验证了其具有抑制dpp-4活性，且其抑制类型与分子对接的结合方式相符。

24、3)本发明通过抑制类型的测定表明，iavp及其功能性变体均为dpp-4的竞争性抑制剂，可以直接与dpp-4的活性位点结合从而竞争性抑制内源性底物glp-1的分解，发挥降血糖的有益调节作用。

25、4)本发明使用所述抑制寡肽的一种功能性变体iavpge干预高脂饮食诱导的2型糖尿病小鼠模型，证明其具有降血糖、降脂、促进胰岛素分泌、改善胰岛素抵抗等作用，可以应用于糖尿病及糖尿病并发症的防治。