一种利用病毒宏基因组学构建加州鲈鱼病毒库的方法

本发明属于生物技术，具体涉及一种利用病毒宏基因组学构建加州鲈鱼病毒库的方法。

背景技术：

1、加州鲈鱼是一种具有适应性强、生长速度快、肉质细嫩等优点的优质淡水鱼。这种淡水鱼原产于北美洲，被认为是世界上最受欢迎的食用类淡水鱼。正是由于该鱼种的诸多优点，被广泛养殖在中国，也成为一种在水产养殖中具有重要经济价值的鱼类。但是随着养殖规模和密度的不断扩大，由真菌、细菌、寄生虫和病毒等不同病原体引起的各类疾病已成为严重威胁加州鲈鱼规模化养殖的重要因素。其中在这些病原体中，由于对各类病毒了解的缺乏及其对应疫苗的空白，大口黑鲈病毒性疾病目前便是对大口黑鲈规模养殖的最大威胁。

2、目前，已有在大口黑鲈中发现多株具有高致病性和死亡率的病毒，如大口黑鲈病毒(lmbv)、大口黑鲈溃疡综合征病毒(lbusv)、鱼呼肠孤病毒(prv)、大口黑鲈弹状病毒(msrv)、双rna病毒、传染性脾肾坏死病毒(isknv)、神经坏死病毒(nnv)、病毒性出血性败血症病毒(vhsv)和鲤鱼春季病毒血症病毒(svcv)、彩虹病毒（iridoviridae）。这些病毒给大口黑鲈的规模化养殖造成了巨大的经济损失。近年来，随着水产微生物研究的不断深入，越来越多的病毒被发现，并且对宿主生态系统的影响也越来越受到关注。而针对加州鲈鱼体内的感染性病毒的系统研究却相对处于空白，因此需要对加州鲈鱼体内的新型病毒深入研究。

技术实现思路

1、本发明利用病毒宏基因组学构建加州鲈鱼病毒库的方法是利用病毒宏基因组学技术，为一种利用高通量测序技术对环境或宿主体内的大量病毒进行快速识别和分类的方法，调查加州鲈鱼体内的潜伏性感染性rna病毒。

2、本发明采用如下技术方案：

3、一种利用病毒宏基因组学构建加州鲈鱼病毒库的方法，包括以下步骤：

4、（1）对加州鲈鱼组织的核酸建库后利用高通量测序技术测序，得到序列信息；

5、（2）对序列信息进行预处理、过滤、去宿主序列，得到有效数据；

6、（3）拼接有效数据，然后将拼接结果与refseq、nr、genebank和cdd数据库比对，得到病毒信息；再进行病毒序列开放阅读框预测，得到病毒基因集；

7、（4）对已知病毒以及新病毒进行分析，构建加州鲈鱼病毒库。

8、一种利用病毒宏基因组学检测加州鲈鱼病毒的方法，包括以下步骤：

9、（1）对加州鲈鱼组织的核酸建库后利用高通量测序技术测序，得到序列信息；

10、（2）对序列信息进行预处理、过滤、去宿主序列，得到有效数据；

11、（3）拼接有效数据，然后将拼接结果与refseq、nr、genebank和cdd数据库比对，得到病毒信息；再进行病毒序列开放阅读框预测，得到病毒基因集，完成加州鲈鱼病毒的检测。

12、本发明目的非疾病的诊断与治疗，公开了一种利用病毒宏基因组学检测加州鲈鱼病毒的方法以及一种利用病毒宏基因组学构建加州鲈鱼病毒库的方法，为了解决现有技术加州鲈鱼体内的感染性病毒的系统研究处于空白的问题，同时，本发明利用病毒宏基因组学构建加州鲈鱼病毒库的方法构建的病毒库也为未来的病毒疫苗研发和治疗提供了新的思路和方法。在构建病毒库的研究中，特别是对于一些结构特殊且不容易被发现的病毒，其研究将改变人们对以往认识的病毒圈的理解。同时，病毒库可以发现不同病毒之间相互的遗传关系，探索不同病毒基因组的多样性和环境对病毒进化的影响。这对疫情的防控和预测具有重要的意义。

13、本发明中，加州鲈鱼组织的核酸提取自加州鲈鱼组织，具体为常规技术，组织包括加州鲈鱼的肝脏、肾脏和胰脏。

14、本发明中，建库前，对核酸进行对rna样品质控；质控标准主要包括以下4个方面：琼脂糖凝胶电泳：分析样品rna完整性及是否存在dna污染；nanophotometerspectrophotometer：检测rna纯度（od260/280及od260/230比值）；qubit2.0 fluorometer：rna浓度精确定量；agilent 2100 bioanalyzer：精确检测rna完整性。

15、本发明中，建库方式为去除核糖体rna建库，首先从总rna中去除核糖体rna，随后在neb fragmentation buffer中用二价阳离子将得到的rna随机打断成250-300bp的短片段，以片段化的rna为模板，以随机寡核苷酸为引物合成cdna第一条链，随后进行pcr扩增建库。优选的，建库完成后，先进行初步定量，随后对文库的插入片段进行检测，符合预期后，qrt-pcr对文库有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。作为示例：先使用qubit2.0fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/ul，随后使用agilent 2100 bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，qrt-pcr对文库有效浓度进行准确定量（文库有效浓度高于2 nm），以保证文库质量。

16、本发明中，测序时，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求拼接后进行illumina测序。测序的基本原理是边合成边测序（sequencing by synthesis）。在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dntp、dna聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dntp就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

17、本发明中，原始数据(raw data)下机后存在一定比例的低质量数据，为保证后续信息分析结果的准确可靠性，首先要对原始数据进行预处理，得到高质量的clean data数据；具体的，测序获得的原始数据中包含少量带有测序接头或测序质量较低的reads，为了保证数据分析的质量及可靠性，需要对原始数据进行过滤，过滤内容如下：去除带接头(adapter)的reads；去除含n(n表示无法确定碱基信息)的reads；去除低质量reads(q<= 20的碱基数占整个 read 长度的 50％以上的 reads)。

18、本发明中，若宿主有参考基因组，将clean data与宿主基因组比对去除宿主的reads，从而得到无宿主污染的有效数据；若无参考基因组这一步省略。

19、本发明中，得到拼接结果后会与refseq，nr，genebank，cdd数据库比对，筛选已知病毒，预测可能潜在的新病毒；具体的，病毒序列orf预测。进一步得到可靠的病毒基因集。

20、通过对测序得到的病毒序列进行注释和比对，确定各个病毒的分类信息，并对未知的新型病毒进行鉴定和分类。对于宏病毒转录组，获得无宿主污染的数据后，会使用拼接软件trinity 分别进行从头组装得到序列信息。使用diamond软件将trinity拼接得到的序列与数据库 genbank 比对，筛选 identify>=90 的病毒序列作为 genbank 数据库注释的已知病毒；将identify<90 和没有比对上序列与 nr 数据库比对，筛选 identify>=90 的病毒序列作为 nr 数据库注释的已知病毒；将 identify<90 和没有比对上的序列与refseq 病毒数据库比对，同理将 identify>=90 的病毒序列作为 refseq 病毒数据库注释的已知病毒，identify<90 和没有比对到 refseq 的序列再比对到 cdd 数据库的序列进行 rdrp 的序列的筛选以确保是 rna 病毒，如果序列注释到 cdd 数据库又具有 rdrp序列，就将其筛选出来，最后将 4 个数据库筛选出来的病毒合并作为已知病毒进行后续的分析。将 genbank 、 nr 和 refseq 病毒数据库中 identify<90 的序列合并，采用deepvirfinder 软件进行新病毒（ novel virus ）预测。

21、进一步的，根据拼接数据预测获得rna病毒基因组序列，设计特异性引物，利用pcr法验证rna病毒的真实性。具体的，从分离的加州鲈鱼组织采用标准提取方法提取rna，随后对rna样品进行质控；然后随机选取特定片段测序设计引物；再使用病毒核酸作为模板，扩增目标病毒的基因区域；将pcr产物加载到琼脂糖凝胶中，并在gel-red荧光染料的作用下进行电泳；dna片段将按大小分离，并将pcr产物进行sanger测序。

22、验证结果表明，本发明方法得到的加州鲈鱼病毒真实，可以作为构建病毒库的数据。

23、宏基因组学是一种先进的技术，可以用于研究特定环境或生物样本中的微生物群落，包括细菌、真菌以及病毒的基因组总和。与传统的微生物学研究方法相比，宏基因组学可以检测到更多的微生物，尤其是难以培养的微生物群落，能够更全面地了解微生物的组成和功能。在宏基因组学的研究中，病毒基因序列一直是一个难点。因为病毒的基因组相对较小，也易受到细菌、真菌等其他微生物群落的“淹没”，从而难以被检测和鉴定。本发明为病毒基因序列的检测和分析提供了一种新的方法和技术，通过建立病毒数据库以及分析病毒基因组中的关键基因序列，可以更加精准地鉴定不同种类的病毒，并快速发现新型病毒，可以应用于病毒感染病例的追溯和预测、病毒与宿主的相互作用研究、病毒生态学研究等领域。同时，本发明利用病毒宏基因组学构建加州鲈鱼病毒库的方法构建的病毒库也为未来的病毒疫苗研发和治疗提供了新的思路和方法。在构建病毒库的研究中，特别是对于一些结构特殊且不容易被发现的病毒，其研究将改变人们对以往认识的病毒圈的理解。同时，病毒库可以发现不同病毒之间相互的遗传关系，探索不同病毒基因组的多样性和环境对病毒进化的影响。这对疫情的防控和预测具有重要的意义。