一种提高mRNA表达水平和表达周期的修饰方法及其应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种提高mrna表达水平和表达周期的修饰方法及其应用。

背景技术：

1、mrna疗法正成为日益重要的治疗各种疾病的方法，mrna疗法涉及向需要该疗法的受试者施用mrna，并在其体内产生治疗作用。治疗用途的高纯度、安全的mrna产物的大规模生产工艺(例如，工业量级如毫克和克级高纯度mrna)成为重要需求。目前常规的mrna获取主要采用两种方法：一是化学合成法，该方法的最大优点是可以规模化大量合成，且可以给特定的碱基加上特定的修饰。但其价格昂贵，且现有合成技术水平只能合成短链rna分子，当合成rna的长度超过170nt后，其合成效率大幅降低，副产物序列增多，极大增加了下游的纯化步骤和成本。二是体外转录，虽然该方法理论上转录长度不受限制，但也存在诸多问题。如需要rna聚合酶，且需要制备大量的质粒并用dna限制性内切酶切成线性质粒或需要通过大量的pcr反应获得线性模板，这极易导致操作过程中引入突变产物。工业级别的酶需求以及大量质粒模板的制备极大增加了成本和放大难度，进一步的，体外转录无法给mrna的特定碱基加特定修饰，polya尾的长度受限制，且长度无法精确控制。

2、目前有规模化合成长链rna的方法及定点修饰长链rna的方法，该方法首先利用化学法合成大量rna短链片段，然后通过合成的dna夹板将rna短链片段连接成长链rna。但该方法操作复杂，化学合成多段rna片段成本高，且多片段连接效率不能保证，也无法打破polya尾的长度限制。因此，提供一种能够提高mrna表达水平和表达周期的修饰类型在基因治疗领域和mrna药物研发中具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种提高mrna表达水平和表达周期的修饰方法及其应用。本发明将体外转录和化学合成相结合，分别利用各自的优势，用特殊设计的夹板将不同的ivt产物(体外转录产物)和不同的化学合成片段高效连接，化学合成的mrna片段可以在末端引入特定的硫代修饰，有效防止外切酶将mrna降解，增加mrna的稳定性和半衰期，可以极大程度的降低mrna的用量，进一步节省成本，降低免疫原性。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种提高mrna表达水平和表达周期的修饰方法，所述修饰方法包括：

4、(1)将一段无任何修饰的mrna、一段含有poly a尾的mrna与dna夹板混合，并用rna连接酶进行连接反应；所述含有poly a尾的mrna的末端有连续4-6个硫代修饰(例如可以是4、5或6)；

5、(2)用dna酶消化掉dna夹板，纯化去除杂质，得到具有高表达水平和表达周期的mrna。

6、本发明中，所述无任何修饰的mrna为通过体外转录制备得到，所述含有poly a尾的mrna通过化学合成制备得到，通过化学合成引入特定位点修饰，再使用rna连接酶和dna夹板将ivt(体外转录)的rna和化学合成的rna连接起来，经过dna酶消化和两步纯化后，获得不同修饰类型的mrna。

7、优选地，步骤(1)中，所述含有poly a尾的mrna的末端有连续5个硫代修饰。

8、优选地，步骤(1)中，所述poly a尾的碱基数为40-50，例如可以是40、42、44、46、48或50。

9、优选地，步骤(1)中，所述poly a尾的5’端含有磷酸化修饰。

10、优选地，步骤(1)中，所述硫代修饰在poly a尾的3’末端。

11、优选地，步骤(1)中，所述dna夹板由互补序列1和互补序列2组成。

12、优选地，所述互补序列1的碱基数为18-22，例如可以是18、19、20、21或22。

13、优选地，所述互补序列2的碱基数为18-22，例如可以是18、19、20、21或22。

14、优选地，所述互补序列1与无任何修饰的mrna的3’末端互补配对。

15、优选地，所述无任何修饰mrna的3’末端含有3-10个碱基冗余，例如可以是3、5、7、9或10。

16、优选地，所述互补序列2与含有poly a尾的mrna的5’末端互补配对。

17、优选地，步骤(1)中，所述连接反应的具体步骤包括：

18、将dna夹板与含有poly a尾的mrna进行退火反应，得到dna夹板适配体；将所得dna夹板适配体、无任何修饰的mrna和rna连接酶孵育。

19、优选地，所述dna夹板与含有poly a尾mrna的摩尔比为1:(0.8-1.2)，例如可以是1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1或1:1.2等。

20、优选地，所述退火反应的程序为：热盖47±2℃，40±2℃孵育1±0.5min，0.2±0.1℃/s降温至16±2℃，16±2℃保温。

21、优选地，所述dna夹板适配体和无任何修饰mrna的摩尔比为1:(1-1.5)，例如可以是1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5等。

22、优选地，所述dna夹板适配体的终浓度为1.8-2.2μm，例如可以是1.8μm、2.0μm或2.2μm等。

23、优选地，所述无任何修饰mrna的终浓度为1-3μm，例如可以是1μm、2μm或3μm等。

24、优选地，所述rna连接酶的终浓度0.8-1.2unit/ul，例如可以是0.8unit/ul、1.0unit/ul或1.2unit/ul等。

25、优选地，步骤(2)中，所述dna酶为dna酶i。

26、优选地，所述dna酶i的反应程序为：热盖47±2℃，37±0.5℃孵育30±0.5min，16±2℃保温。

27、优选地，步骤(2)中，所述纯化的步骤包括：采用氯化锂溶液对消化后的mrna进行沉淀，孵育后离心收集沉淀；采用oligo d(t)磁珠纯化连接成功的mrna。

28、优选地，所述氯化锂溶液的终浓度为1-1.25m，例如可以是1m、1.1m、1.2m或1.25m等。

29、优选地，所述修饰方法包括：

30、(1)将dna夹板与含有poly a尾的mrna进行退火反应，所述dna夹板与含有poly a尾的mrna的摩尔比为1:(0.8-1.2)，所述退火反应的程序为：热盖47±2℃，40±2℃孵育1±0.5min，0.2±0.1℃/s降温至16±2℃，16±2℃保温，得到dna夹板适配体；将终浓度为1.8-2.2μm的dna夹板适配体、终浓度为1-3μm的无任何修饰的mrna混合和rna连接酶孵育，所述dna夹板适配体和无任何修饰mrna的摩尔比为1:(1-1.5)；所述rna连接酶的终浓度为0.8-1.2unit/ul；

31、所述含有poly a尾的mrna的末端有连续4-6个硫代修饰，所述poly a尾的碱基数为40-50；所述poly a尾5’端含有磷酸化修饰；所述硫代修饰在poly a尾的3’末端；

32、所述dna夹板由碱基数为18-22的互补序列1和碱基数为18-22的互补序列2组成；所述互补序列1与无任何修饰mrna的3’末端互补配对，所述无任何修饰mrna的3’末端含有3-10个碱基冗余，所述互补序列2与含有poly a尾mrna的5’末端互补配对；

33、(2)用dna酶消化掉dna夹板，采用终浓度为1-1.25m氯化锂溶液对消化后的mrna进行沉淀，孵育后离心收集沉淀；采用oligo d(t)磁珠纯化连接成功的mrna。

34、第二方面，本发明提供第一方面所述的提高mrna表达水平和表达周期的修饰方法在制备mrna药物中的应用。

35、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

36、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

37、本发明将体外转录和化学合成相结合，分别利用各自的优势，用特殊设计的夹板将不同的ivt产物和不同的化学合成片段高效连接，化学合成的mrna片段可以在末端引入特定的硫代修饰，有效防止外切酶将mrna降解，增加mrna的稳定性和半衰期，可以极大程度的降低mrna的用量，进一步节省成本，降低免疫原性。