产气荚膜梭菌蛋白ArcB、rpsB、TmpC多克隆抗体的制备和应用

本发明涉及基因工程，更具体的说是涉及产气荚膜梭菌免疫原性蛋白arcb、rpsb、tmpc多克隆抗体的制备和应用。

背景技术：

1、禽坏死性肠炎(ne)是由g型产气荚膜梭菌(clostridium perfringens,cp)的致病菌株引起的一种复杂的多因素鸡和火鸡肠道疾病，对全球家禽业产生重大经济影响。目前，对于ne的临床检测大多是针对α毒素或netb毒素，然而，研究表明，α毒素或netb毒素缺失的菌株仍能够在鸡中引起对坏死性肠炎的免疫保护，证明，cp菌中存在其他的抗原也可产生免疫保护，并且可能是临床检测中的靶点。

2、arcb是鸟氨酸氨基甲酰转移酶，在肉毒梭菌中被鉴定为免疫原性蛋白，在猪链球菌中与小鼠模型中的生物膜形成，粘附和毒力相关。tmpc是一种膜脂蛋白，属于bmp家族abc转运蛋白底物结合蛋白，负责转运嘌呤核苷，在梅毒螺旋体有免疫原性。rpsb是30s核糖体蛋白s2，可能与猪链球菌在感染过程中的存活有关，在肺炎衣原体中是潜在的药物和疫苗靶点。这些蛋白可能是cp菌的潜在免疫抗原，制备这些蛋白的多克隆抗体有利于产气荚膜梭菌的临床检测和ne发病机制的研究。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题，提供产气荚膜梭菌蛋白arcb、rpsb、tmpc多克隆抗体的制备和应用。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、第一方面，本发明提供一种产气荚膜梭菌蛋白多克隆抗体的制备方法，所述制备方法如下：

4、步骤1，pcr扩增产气荚膜梭菌基因序列并使用同源重组的方法插入表达载体，形成重组表达质粒；

5、步骤2，随后将重组表达质粒转化至工程菌大肠杆菌中，挑取单克隆株，通过pcr和测序鉴定，鉴定正确的克隆株为阳性克隆株，即获得蛋白的表达菌株；

6、步骤3，对步骤2中的蛋白的表达菌株进行表达、纯化与鉴定得到产气荚膜梭菌蛋白；

7、步骤4，将纯化的产气荚膜梭菌蛋白稀释与等体积的quickabody-mouse3w佐剂混合，在小鼠腿部肌肉内免疫两次，最后一次免疫后一周，从免疫和未免疫小鼠中采集血样离心，得到多克隆抗体。

8、进一步地，所述产气荚膜梭菌蛋白的氨基酸序列如seq id no.4所示；

9、步骤1具体为：从产气荚膜梭菌全基因序列中获得arcb的基因序列，序列如seq idno.1所示；pcr扩增arcb的基因序列并使用同源重组的方法插入表达载体pet28a，形成表达质粒pet28a-arcb；引物序列：arcb-f:5’-atgggtcgcggatccgaattcatggcagttaacttaaaaggaagaagc-3’,arcb-r:5’-gtggtggtggtggtgctcgagttatcttccagcagttgctaccat-3’；扩增程序：98℃预变性2nin，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，35个循环，延伸5min；

10、步骤2中所述的工程菌大肠杆菌为工程菌大肠杆菌bl21，获得蛋白的表达菌株为bl21(pet28a-arcb)。

11、进一步地，步骤3具体为：将bl21(pet28a-arcb)接种含有卡那霉素的液体lb培养基中，其中卡那霉素的浓度为25μg/ml，37℃震荡培养至od600值为0.7，加入终浓度为0.5mmol/ml的iptg在37℃诱导培养4h，离心收集菌体，使用pbs重悬菌体；菌体超声破碎后，在4℃条件下9000rpm/min转速离心10min收集上清，使用high-affinity ni-nta resin进一步对收集的上清进行纯化；蛋白使用洗脱液洗脱。

12、进一步地，所述产气荚膜梭菌蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示；

13、步骤1具体为：从产气荚膜梭菌全基因序列中获得rpsb的基因序列，序列如seq idno.2所示；pcr扩增rpsb的基因序列并使用同源重组的方法插入表达载体pet28a，形成表达质粒pet28a-rpsb；引物序列：rpsb-f:5’-atgggtcgcggatccgaattcatgtcagtaatttcaatgaaacaattatt ag-3’,rpsb-r:

14、5’-gtggtggtggtggtgctcgagttactctgctaattgctcgcctt-3’；扩增程序：98℃预变性2nin，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，35个循环，延伸5min；

15、步骤2中所述的工程菌大肠杆菌为工程菌大肠杆菌bl21，获得蛋白的表达菌株为bl21(pet28a-rpsb)。

16、进一步地，步骤3具体为：将bl21(pet28a-rpsb)接种含有卡那霉素的液体lb培养基中，其中卡那霉素的浓度为25μg/ml，37℃震荡培养至od600值为0.7，加入终浓度为0.5mmol/ml的iptg在37℃诱导培养4h，离心收集菌体，使用pbs重悬菌体；菌体超声破碎后，在4℃条件下9000rpm/min转速离心10min收集上清，使用high-affinity ni-nta resin进一步对收集的上清进行纯化；蛋白使用洗脱液洗脱。

17、进一步地，所述产气荚膜梭菌蛋白的氨基酸序列如seq id no.6所示；

18、步骤1具体为：从产气荚膜梭菌全基因序列中获得tmpc的基因序列，序列如seq idno.3所示；pcr扩增tmpc的基因序列并使用同源重组的方法插入表达载体pet32a，形成表达质粒pet32a-tmpc；引物序列：tmpc-f:5’-gccatggctgatatcggatccggtgatactggttctaagggagaca-3’,tmpc-r:5’-ctcgagtgcggccgcaagcttatttattaagtctccttgctcatt agaaa-3’；扩增程序：98℃预变性2nin，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，35个循环，延伸5min；

19、步骤2中所述的工程菌大肠杆菌为工程菌大肠杆菌bl21，获得蛋白的表达菌株为bl21(pet32a-tmpc)。

20、进一步地，步骤3具体为：将bl21(pet32a-tmpc)接种含有氨苄青霉素的液体lb培养基中，其中氨苄青霉素的浓度为25μg/ml，37℃震荡培养至od600值为0.7，加入终浓度为0.5mmol/ml的iptg在37℃诱导培养4h，离心收集菌体，使用pbs重悬菌体；菌体超声破碎后，在4℃条件下9000rpm/min转速离心10min收集上清，使用high-affinity ni-ntaresin进一步对收集的上清进行纯化；蛋白使用洗脱液洗脱。

21、进一步地，pbs的配方为：kcl 0.2g，nacl 8g，na2hpo4 1.44g，kh2po40.24g，1000ml蒸馏水，ph 7.4；洗脱液为60mm nah2po4,300mm nacl,500mm imidazole,ph 8.0。

22、第二方面，本发明提供一种利用所述的制备方法得到的产气荚膜梭菌蛋白多克隆抗体，产气荚膜梭菌蛋白多克隆抗体为arcb、rpsb或tmpc多克隆抗体。

23、第三方面，本发明提供利用所述的制备方法得到的产气荚膜梭菌蛋白多克隆抗体在检测产气荚膜梭菌蛋白免疫原性和亚细胞定位中的应用。

24、本发明具有以下有益效果：本发明公开了产气荚膜梭菌蛋白arcb、rpsb、tmpc多克隆抗体制备以及应用。elisa结果表明制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价，westernblot试验验证arcb、rpsb、tmpc阳性血清特异性较好。western blot检测arcb、rpsb、tmpc多克隆抗体与产气荚膜梭菌具有良好的反应性，表明产气荚膜梭菌蛋白arcb、rpsb、tmpc具有良好的免疫原性。

25、本发明提供的arcb、rpsb、tmpc多克隆抗体对产气荚膜梭菌的检测及相关研究工作具有重要意义，具有较大的市场应用潜力和潜在的经济效益。