一种能够识别DHAV-3VP1蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种能够识别dhav-3 vp1蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用。

背景技术：

1、鸭甲型病毒性肝炎是由鸭甲型肝炎病毒(dhav)引起的雏鸭的急性、高度致死性传染病，是危害养鸭业的头号杀手。目前，dhav-1与dhav-3在鸭群中共同流行，而dhav-3正逐渐占据优势流行地位。

2、疫苗接种是鸭甲型病毒性肝炎防控的重要手段。目前，临床上主要使用dhav减毒活疫苗与灭活疫苗进行鸭群的免疫接种与疫病防控。减毒活疫苗是将野毒株在鸡胚中进行多次连续传代致弱而获得，灭活疫苗是将dhav野毒株在鸡胚中扩增后，用化学物质处理消除病毒感染性，再加入佐剂制备而获得。

3、由于活疫苗与灭活疫苗的生产均高度依赖鸡胚，而鸡胚培养存在成本较高、供应不稳定、存在内源病毒(鸡白血病病毒等)污染、鸡胚残体废弃物产量大等缺陷。因此，研究者利用了诸多的技术平台构建新型dhav疫苗，旨在替代传统的鸡胚化疫苗。其中，基于杆状病毒表达系统构建的亚单位疫苗在替代鸡胚化疫苗方面有较大的潜力。

4、亚单位疫苗是在杆状病毒中表达dhav的保护性抗原vp1蛋白，再将含有vp1蛋白的表达产物进行灭活、乳化等工艺操作制备得到。由于含有dhav最主要的保护性抗原，亚单位疫苗的免疫原性和保护效力均较强。由于家禽疫苗的生产成本不能过高，为了节约生产成本，一般使用杆状病毒接种昆虫细胞，获得的粗抗原产物用于亚单位疫苗的制备。表达产物中含有的大量杆状病毒及昆虫细胞的蛋白会极大地干扰dhav抗原蛋白的精准定量。

5、目前，缺少能够对dhav-3 vp1蛋白进行精准定量的技术方法，以检验亚单位疫苗的有效抗原含量，这是限制dhav亚单位疫苗研制与产业化的一个重要的技术问题。有报道在大肠杆菌或杆状病毒系统中表达dhav的vp1蛋白，通过向vp1蛋白添加标签，再利用标签进行蛋白的纯化，通过测定蛋白浓度检验疫苗的抗原含量。这些方法需要对表达的蛋白进行纯化，操作复杂、成本较高、时间较长，不适用于家禽疫苗生产的实际需求。

技术实现思路

1、为了解决dhav-3亚单位疫苗抗原定量方法缺失的技术问题，本发明提供了一种能够识别dhav-3 vp1蛋白的单克隆抗体、制备方法及其应用，还提供了一种针对dhav-3 vp1蛋白的双抗夹心elisa方法，可用于dhav-3亚单位疫苗抗原的定量、疫苗的质量控制与动物免疫剂量的确定。

2、本发明提供的技术方案如下：

3、一种能够识别dhav-3 vp1蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区；

4、所述重链可变区包含vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，所述轻链可变区包含vl cdr1、vlcdr2和vl cdr3；

5、所述的vh cdr1的氨基酸序列为seq id no：7所示；

6、所述的vh cdr2的氨基酸序列为seq id no：8所示；

7、所述的vh cdr3的氨基酸序列为seq id no：9所示；

8、所述的vl cdr1的氨基酸序列为seq id no：10所示；

9、所述的vl cdr2的氨基酸序列为seq id no：11所示；

10、所述的vl cdr3的氨基酸序列为seq id no：12所示。

11、进一步的，重链可变区氨基酸序列如seq id no：13所示；轻链可变区氨基酸序列如seq id no：14所示。

12、本发明还提供一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码上述的能够识别dhav-3 vp1蛋白的单克隆抗体。

13、进一步的，所述核苷酸分子的序列选自seq id no：15和seq id no：16；

14、序列seq id no：15编码所述单克隆抗体的重链可变区；

15、序列seq id no：16编码所述单克隆抗体的轻链可变区。

16、本发明还提供一种表达载体，所述表达载体含有上述的核苷酸分子。

17、本发明还提供上述的能够识别dhav-3 vp1蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

18、将纯化的vp1蛋白作为免疫原对小鼠进行免疫，通过杂交瘤技术制备得到能够识别dhav-3 vp1蛋白的单克隆抗体。

19、进一步的，编码上述的vp1蛋白的基因扩增引物序列为：

20、vp1-f:5-ttgaattcatgggtgattccaatca-3；

21、vp1-r:5-ttctcgagttattcaatttcgagat-3。

22、本发明还提供上述的能够识别dhav-3 vp1蛋白的单克隆抗体在制备dhav-3 vp1蛋白检测试剂中的应用。

23、本发明还提供一种基因3型鸭甲型肝炎病毒vp1蛋白定量的双抗夹心elisa方法，采用上述的能够识别dhav-3 vp1蛋白的单克隆抗体作为捕获抗体，测定vp1蛋白浓度。

24、进一步的，以vp1兔多克隆抗体作为检测抗体。

25、进一步的，所述能够识别dhav-3 vp1蛋白的单克隆抗体的稀释倍数为250～16000倍，最优稀释倍数为1:16000。

26、所述方法以一株能够识别dhav-3 vp1蛋白的单克隆抗体为捕获抗体捕获待测样品中的抗原成分，以针对vp1蛋白的多克隆抗体为检测抗体，从而对捕获的抗原进行定量。

27、进一步地，本发明提供了一株dhav-3 vp1蛋白特异性的鼠源单克隆抗体2c11作为抗原捕获抗体，该抗体是以表达的vp1蛋白为免疫原，通过杂交瘤技术制备的鼠源单克隆抗体。

28、进一步地，本发明还提供了一株dhav-3 vp1蛋白特异性的兔源多克隆抗体，作为抗原的检测抗体，该抗体是以表达的vp1蛋白为免疫原，从接种的新西兰大白兔的血清中纯化获得的多克隆抗体。

29、进一步地，本发明还提供了一种dhav-3的vp1蛋白，该蛋白含有his标签，是在大肠杆菌中表达并通过镍柱亲和层析纯化的，用作双抗夹心elisa的蛋白标准品。

30、进一步地，本发明还提供了双抗夹心elisa的操作方法，主要包括：捕获抗体2c11以优选稀释度1:16000倍稀释，包被酶标板，4℃包被过夜；封闭液为含有5％脱脂奶的pbst，37℃封闭1h；vp1蛋白标准品优选0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/ml、0.015625μg/ml、0.0078μg/ml共八个浓度，用于标准曲线的绘制，孵育条件为37℃1h；检测抗体以优选稀释度1:1000倍稀释，37℃孵育1h；辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗兔igg以优选稀释度1:5000倍稀释，37℃孵育1h；底物四甲基联苯胺(tmb)于室温孵育20min，之后加入2m硫酸溶液终止反应；在od450下读取吸光值。

31、进一步地，本发明还提供了一种表达vp1蛋白的重组杆状病毒在昆虫细胞sf9中的表达产物，用作夹心elisa的待检样品。

32、进一步地，本发明还提供了一种杆状病毒-昆虫细胞表达产物中vp1蛋白定量的方法，具体包括：捕获抗体2c11以1:16000倍稀释，包被酶标板，4℃包被过夜；用含有5％脱脂奶的pbst进行封闭，37℃孵育1h；以不同浓度的vp1蛋白(0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml、0.03125μg/ml、0.015625μg/ml、0.0078μg/ml)绘制标准曲线，同时加入杆状病毒表达产物，孵育条件为37℃1h；检测抗体以1:1000倍稀释，37℃孵育1h；hrp标记的羊抗兔igg以1:5000倍稀释，37℃孵育1h；加入tmb底物，室温孵育20min；加入2m硫酸溶液终止反应；在od450下读取吸光值；根据vp1蛋白标准品绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测表达产物中vp1蛋白含量。

33、本发明的主要目的通过下述技术方案实现：dhav-3 vp1蛋白的表达与纯化；dhav-3 vp1蛋白特异性单克隆抗体的制备与鉴定；双抗夹心elisa方法的建立与参数优化；双抗夹心elisa方法在测定杆状病毒表达产物中dhav-3 vp1蛋白含量的应用。

34、有益效果

35、现有技术将不同表达系统中表达的vp1蛋白进行纯化，通过测定蛋白浓度检验抗原含量。该方法成本高、操作复杂、周期长，只能在实验室条件下进行，难以在规模化生产环境下应用。而本发明提供的双抗夹心elisa方法可对表达产物中的dhav-3 vp1蛋白进行定量，灵敏度可达6.25ng、线性范围从0.0625至1μg/ml、可在3h以内完成检测，可用于dhav-3新型蛋白亚单位疫苗的抗原定量，为dhav-3免疫效力的评价与疫苗的质量控制提供了一种新的方法，可保障dhav-3疫苗的升级换代。