一种可用于民猪选育的15K液相芯片制备方法及基因分型方法

本发明属于生物育种，具体涉及一种可用于民猪选育的15k液相芯片制备方法及基因分型方法。

背景技术：

1、“种业振兴，良种先行”，优良种猪群体是现代生猪产业发展的前提和基础，在促进增产提效方面具有十分关键的作用。我国的地方猪遗传资源是五千年农耕文明流传下来的宝贵财富，是传承中华文明的鲜活载体，也是维护国家生态安全和农业安全的重要战略资源。保护好利用好地方猪遗传资源，对于提升我国畜牧业综合生产能力和核心竞争力，深入实施乡村振兴战略，更好满足广大人民日益增长、不断升级和个性化的畜产品需求意义重大。

2、由于遗传变异的存在，不同品种或群体才表现出表型差异。遗传变异主要通过遗传标记反映，目前被广泛应用的遗传标记是分子水平的snp标记。snp标记的主要检测方法为芯片检测法和高通量测序法。利用芯片进行snp检测，具有操作简便、通量高等特点，目前主要有固相芯片和液相芯片两种。在猪上，已经有成熟的商业芯片如60k芯片(porcinesnp60)、中芯一号芯片等，它们均为固相芯片。在使用中，人们逐渐发现固相芯片存在一些缺点，如①检测位点固定，不灵活，更新换代慢。②标记位点与整个基因组相比，数量相对较少，大量的基因组遗传变异不会被检出。③检测位点具有群体特异性，以猪的60k芯片为例，其位点设计的信息来源于野猪和一些常见的引进品种(杜洛克猪、长白猪、大白猪、皮特兰猪)，因此利用该芯片检测其他群体(如一些地方品种)，则可能由于较大的群体间遗传差异而使得适用性较差。④由于固相芯片是基于已有的先验知识设计而成，因此对于群体内新出现的突变，固相芯片技术无法检出。液相芯片在一定程度上弥补了固相芯片的不足，位点挑选更灵活，snp数量选择范围更宽，可针对特定群体设计特有的检测芯片等。

3、目前，猪上成熟的商用芯片依旧以固相芯片为主，但以靶向捕获测序技术为主的液相芯片研制，也已获得多种产品，如针对家驴基因组检测的“家驴一号”芯片，针对牦牛基因组选育的“蜀芯1号”芯片，以及首款中国地方鸡专用芯片“神农1号”等。液相芯片除了保留检测准确性高的优点和价格较低之外，它还具有独立的自主知识产权、开发的snp芯片密度可以灵活调整、可随时补充新的位点、可与其他芯片组合使用、可针对某一群体设计专用芯片、无样本量限制等优点。

4、如cn 112921076 a，发明名称《一种基于靶向捕获测序的猪50k液相芯片的制备方法及其应用》，所述猪50k液相芯片由独立包装的猪50k探针混合液和杂交捕获试剂构成，所述猪50k探针为dna双链探针，是根据所筛选的snp位点设计并合成的核苷酸序列；所述snp位点是将猪的全基因组测序结果比对至猪参考基因组上进行snp位点的筛选。利用本发明制备的猪50k液相芯片与猪dna高通量测序文库混合，捕获猪dna高通量测序文库中包含目标位点的dna片段进行扩增和纯化，产物经过高通量测序后，利用测序结果回帖到猪参考基因组上进行比对，从而获取待测猪的基因组基因分型。采用本发明制备的50k液相芯片对猪只进行基因分型，可以解决现有技术成本高、不灵活、不能在我国猪场中的大规模使用的问题。本发明提供了基于靶向捕获测序进行基因分型的猪高通量snp50k探针，探针设计的时候考虑到了捕获的snp位点在全基因组的分布情况，而且捕获探针考虑了位点多态性的问题，在杜洛克、长白猪、大白猪群体中maf要求大于0.35，有效地避免了简化基因组测序分型技术可能导致的标记密度不均匀和多态性较差问题。

5、该专利的猪50k液相芯片是基于引入品种杜长大设计研发而成，并不适合我国地方猪品种，本研究所研发的液相芯片，不仅适用于民猪，而且可推广至其他地方猪。同时，本专利选用的snp位点数量与50k液相芯片相比，减少了35000个，极大的减少了使用成本，但仍可满足基因分型需要。

6、民猪是我国华北型猪种的典型代表，是东北地区唯一入选国家级保护品种，曾是东北地区的当家猪种。它具有肉质优良、繁殖力高、耐寒、耐粗饲等优异特性，但也存在生长速度慢、瘦肉率低等劣势。上世纪八十年代，我国地方猪种受到了引进猪种的冲击，养殖数量锐减。近些年随着人民生活水平的提高，对高档猪肉的需求与日俱增，民猪等地方猪资源再次得到市场青睐。然而受目前实际生产水平的限制，民猪的优良种质特性未得到充分开发利用。民猪优良种质特性的挖掘和鉴定工作整体较为落后，亦未有成熟的相关分子鉴定方法与标准，很大程度上阻碍了民猪的合理开发与利用。snp芯片现已广泛应用于畜禽性状遗传解析和育种实践，但目前应用于猪的snp芯片都是针对引进品种研发设计，并不适用于我国地方猪种，因此开发一款适用于民猪的基因分型检测产品十分符合现阶段地方猪产业发展的需求，将有效推进民猪种质资源保护和未来育种改良工作。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种针对民猪群体，基于民猪全基因组测序结果的15k液相芯片制备方法和基因分型方法，解决目前缺少地方猪保种和选育用芯片、固相芯片不灵活的问题。

2、本发明的一种可用于民猪选育的15k液相芯片制备方法，所述的液相芯片由民猪15k探针混合液和杂交捕获剂构成；所述的15k液相芯片制备方法包括以下步骤：

3、步骤一、选择民猪，提取耳组织dna并储存备用；

4、步骤二、对提取的民猪耳组织dna进行全基因组重测序，在全基因组水平筛选snp位点，建立能够覆盖民猪群体的snp位点集合，获得了15000个snp位点；

5、步骤三、对所筛选出的15000个snp位点，遵循液相捕获技术的探针设计原则，分别合成两条长度为110bp，5’端带有生物素基因修饰的dna核苷酸序列，并定义为探针；

6、步骤四、将步骤三合成后的探针进行等摩尔质量混合，利用edta和tris-hcl混合液定容，得到15k探针混合液，并与杂交捕获试剂组合使用，得到所述的可用于民猪选育的15k液相芯片。

7、进一步地，步骤二中所述的对提取的民猪耳组织dna进行全基因组重测序是指：

8、对提取的民猪耳组织dna的重测序原始下机数据使用软件fastp进行数据处理，得到高质量数据，所述的高质量数据获取具体步骤如下：1)去除接头序列；2)去除n的含量超过读长长度10％的成对读长；3)去除低质量碱基数超过读长长度40％的成对读长，所述的低质量为q≤20；4)获得高质量的干净读长。

9、进一步地，所述的获得高质量的干净读长，是对去除低质量碱基数的读长，进行生物信息学分析，得到高质量snp数据，具体步骤如下：1)使用软件bwa将完成质控后的干净读长与猪参考基因组序列进行比对，通过比对定位干净读长在参考基因组上的位置；所述的完成质控指高质量数据获取中完成去除低质量碱基数的读长；2)依据步骤1)的结果，使用软件gatk的haplotypecaller模块进行变异检测，检测参数为：gatk best practices；使用软件gatk的variantfiltration模块进行过滤，过滤参数为：--filter-expression"qd<2.0||qual<30.0||mq<40.0||fs>60.0||sor>3.0||mqranksum<-12.5||readposranksum<-8.0"；3)根据参考基因组(sus scrofa 11.1)的注释文件，在参考基因组注释文件的snp数据集基础上进行位置注释，获得高质量snp位点数据。

10、进一步地，步骤二中，在全基因组水平筛选snp位点，筛选原则为：挑选的snp位点要在全基因组均匀分布，每个snp位点的最小等位基因频率大于0.35。

11、进一步地，步骤三中，遵循液相捕获技术的探针设计原则，所述的探针设计原则为：探针长度110bp；探针gc含量在30-70％之间、同源性区域个数≤5；设计两条有60-70％重叠且覆盖所属snp位点所述snp位点的核苷酸序列；5’端带有生物素基因修饰。

12、进一步地，步骤四中，所述的利用edta和tris-hcl混合液定容为3pmol/ml的15k探针混合液。

13、本发明所制备的一种可用于民猪选育的15k液相芯片的基因分型方法，是富集捕获待测民猪个体的snp位点信息，通过高通量测序，利用可用于民猪选育的15k液相芯片对待测个体进行基因分型。

14、进一步地，所述的利用可用于民猪选育的15k液相芯片对待测个体进行基因分型具体为：首先提取待测民猪的基因组dna构建高通量测序文库，然后将可用于民猪选育的15k液相芯片的探针，与待测民猪的dna高通量测序文库混合，捕获待测民猪dna高通量测序文库中包含目标位点的dna片段；对获得的dna片段进行扩增和纯化，产物经过高通量测序后，利用bwa和gatk软件分析获得待测个体的snp基因分型。

15、进一步地，构建待测民猪dna高通量测序文库的方法为：采用酶切方法对待测民猪基因组dna进行片段化，并通过末端补平加a尾、连接测序接头、pcr扩增，获得待测民猪dna高通量测序文库，并利用qubit对待测民猪dna高通量测序文库的浓度进行检测。

16、进一步地，捕获待测民猪dna高通量测序文库中包含目标位点dna片段的方法为：将含有生物素的可用于民猪选育的15k液相芯片中的探针和链霉亲和素覆盖的磁珠混合，通过生物素和链霉亲和素的结合，使待测民猪基因组dna片段被吸附到磁珠上，然后通过洗脱处理将非目标区域的dna片段洗掉，从而获得所要求的待测民猪基因组dna片段。

17、进一步地，所述的杂交捕获试剂为来自石家庄博瑞迪生物技术有限公司的genobaits dna-seq library prep试剂盒，包括独立包装的genobaits block i、genobaits block ii、genobaits 2×hybbuffer、genobaits hyb buffer enhancer、genobaits 2×beads wash buffer、genobaits10×wash buffer i、genobaits 10x washbuffer ii、genobaits 10x wash buffer iii、genobaits 10x stringent wash buffer。

18、本发明包含了以下有益效果：

19、本发明开发了一种可用于民猪选育的15k液相芯片制作方法，与当前的snp芯片相比，是针对民猪的专门化芯片，因此在民猪选育上的应用可提高选种准确性，缩短世代间隔。

20、本发明的民猪15k液相芯片由独立包装的民猪15k探针混合液和杂交捕获试剂构成，所述民猪15k探针为dna双链探针，是针对民猪全基因组序列筛选的snp位点设计并合成的核苷酸序列；所述snp位点是对30头纯种民猪的全基因组序列开展12×深度测序后，将民猪的全基因组测序结果比对至猪参考基因组(sus scrofa 11.1版本)上进行的snp位点筛选。利用本发明制备的民猪15k液相芯片与待测民猪dna高通量测序文库混合，捕获待测民猪dna高通量测序文库中包含目标位点的dna片段进行扩增和纯化，产物经过高通量测序后，将测序结果回帖到猪参考基因组上进行比对，从而获取待测民猪的基因组基因分型。采用本发明制备的15k液相芯片可对民猪个体进行基因分型，可用于民猪保种和选育工作，解决我国目前缺少专门针对地方猪品种选育用芯片的问题。

21、《一种基于靶向捕获测序的猪50k液相芯片的制备方法及其应用》所研发的猪50k液相芯片是基于引入品种杜长大设计研发而成，并不适合我国地方猪品种，本发明的液相芯片，不仅适用于民猪，而且可推广至其他地方猪。同时，本发明选用的snp位点数量与50k液相芯片相比，减少了35000个，极大的减少了使用成本，但仍可满足基因分型需要。