具有异源抗原的活的减毒黄病毒

背景技术：

技术实现思路

1、本发明涉及包含黄热病病毒序列的多核苷酸，其中编码所述黄热病病毒的核苷酸序列前面是黄热病病毒衣壳蛋白的n末端部分，接着是t细胞抗原或其包含t细胞抗原的一部分，以及编码thosea asigna 2a肽的序列。

2、通常，与全长黄热病病毒序列中的相应序列相比，衣壳基因的n末端部分的核苷酸序列具有一个或多个同义密码子。

3、在一个实施方案中，所述黄热病病毒衣壳的末端部分编码由序列msgrkaqgktlgvnmvrrgvr(seq id no：2)组成的肽。

4、在一个实施方案中，所述thosea asigna 2a肽具有序列egrgslltcgdveenpgp(seqid no：16)。

5、在一个实施方案中，t2a肽的c末端氨基酸是gly、ala、ser或thr。

6、在一个实施方案中，其中所述抗原的密码子使用适合于在细菌中表达。

7、在一个实施方案中，具有同义密码子的序列是：

8、atgtctggtcgtaaagctcagggaaaaaccctgggcgtcaatatggtacgacgaggagttcgc(seqid no:14)

9、和

10、agcggccgcaaagcccagggtaagacactgggcgtgaacatggttcgtcgcggcgtccgg(seq idno:15)。

11、在一个实施方案中，所述黄热病病毒是yf 17d减毒病毒。

12、在一个实施方案中，所述多核苷酸是细菌人工染色体(bacterial artificialchromosome)。

13、在一个实施方案中，所述bac包含用于将所述bac扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列以及病毒表达盒，该病毒表达盒包含所述多核苷酸的cdna并包含用于在哺乳动物细胞中转录所述病毒cdna和用于将转录的rna加工成感染性rna病毒的顺式调节元件。

14、在一个实施方案中，所述t细胞抗原选自由hbc核心抗原、ova和ebna1组成的组，即所编码的t细胞抗原包含seq id no：3的氨基酸序列或其包含t细胞表位的片段，所编码的t细胞抗原包含seq id no：7的氨基酸序列或其包含t细胞表位的片段，所编码的t细胞抗原包含seq id no：10的氨基酸序列或其包含t细胞表位的片段；所编码的t细胞抗原包含seqid no：13的氨基酸序列。

15、这样的多核苷酸能够用作疫苗，更具体地用作预防由所述t细胞抗原或部分t细胞表位引起的感染的疫苗。

16、此外，上述多核苷酸能够用作同时预防由所述t细胞抗原或部分t细胞表位引起的感染和黄热病感染的疫苗。

17、本文公开了制备针对t细胞抗原的疫苗的方法，其包括步骤：

18、(a)提供一种bac，其包含用于将所述bac扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列，以及

19、病毒表达盒，其包含如上面所描述的多核苷酸的cdna，并包含用于在哺乳动物细胞中转录所述病毒cdna和用于将转录的rna加工成感染性rna病毒的顺式调节元件

20、(b)用步骤(a)所述的bac转染哺乳动物细胞

21、(c)验证步骤(b)的转染细胞所复制的病毒的毒力和产生针对所述t细胞抗原的抗体的能力，将步骤(c)中验证的病毒克隆到载体中，

22、将所述载体配制成疫苗制剂。

23、本文所述的载体是bac，其可包含用于将所述bac扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列。

24、本发明同样适用于其他黄病毒(flavivirus)，其中t细胞抗原被克隆到衣壳蛋白的n末端。

25、本发明同样适用于嵌合黄热病株，其中yfv的prme基因被其他黄病毒(例如，日本脑炎或登革热)的prme基因取代。

26、在以下声明中进一步总结了本发明：

27、1.包含黄病毒序列的多核苷酸，其特征在于编码所述黄病毒的核苷酸序列前面是编码以下的序列：

28、-黄病毒衣壳蛋白的部分，其包含黄病毒衣壳蛋白的n末端部分或由黄病毒衣壳蛋白的n末端部分组成，

29、-免疫原性蛋白质，或其包含免疫原性肽的部分，以及

30、-2a切割肽。

31、为了疫苗接种的目的，这些黄病毒通常是活的感染性减毒病毒。

32、2.根据声明1所述的多核苷酸，其中所述黄病毒衣壳蛋白的部分包含黄病毒衣壳蛋白的21个n末端氨基酸或由黄病毒衣壳蛋白的21个n末端氨基酸组成。

33、21个aa的实施方案基于用yfv进行的实施例，但是根据黄病毒的类型可以有所不同，并且对于日本脑炎病毒能够短至16个氨基酸。

34、除了16至21个氨基酸的最小必需n末端外，取决于所考虑的黄病毒，嵌合病毒可在插入位点之前包含衣壳蛋白的另一部分，使得衣壳的n末端片段可具有25、30、35、40或50个氨基酸的长度，因为已经描述了具有34个氨基酸的n末端片段的登革热病毒构建体(fischl&bartenschlager(2013)methods mol.biol.1030,205-219)。

35、3.根据声明1或2所述的多核苷酸，其中编码衣壳基因的n末端部分的核苷酸序列与全长病毒序列中的相应序列相比具有一个或多个同义密码子。

36、4.根据声明1、2或3所述的多核苷酸，其中所述黄病毒是黄热病病毒。

37、5.根据声明1至4中任一项所述的多核苷酸，其中黄热病病毒衣壳的末端部分由序列msgrkaqgktlgvnmvrrgvr(seq id no：2)组成。

38、6.根据声明1至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述2a切割肽包含序列dxexnpgp[seq id no：46]。

39、7.根据声明1至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述2a切割肽包含序列lxxxgdvexpgp[seq id no：17]。

40、8.根据声明1至7中任一项所述的多核苷酸，其中所述2a切割肽包含序列lltcgdveenpgp[seq id no：18]。

41、9.根据声明1至8中任一项所述的多核苷酸，其中所述2a切割肽是具有氨基酸序列egrgslltcgdveenpgp(seq id no：16)的thosea asigna 2a肽。

42、10.根据声明1至9中任一项所述的多核苷酸，其中所述2a切割肽的c末端氨基酸是gly、ala、ser或thr。

43、11.根据声明1至10中任一项所述的多核苷酸，其中所述免疫原性蛋白质是t细胞抗原且其免疫原性片段包含t细胞表位。

44、12.根据声明1至11中任一项所述的多核苷酸，其中编码所述免疫原性蛋白质或其片段的序列的5'的编码衣壳蛋白的核苷酸序列具有野生型黄病毒的核苷酸序列。

45、13.根据声明1至11中任一项所述的多核苷酸，其中所述免疫原性蛋白质或其免疫原性片段的密码子使用适合于在细菌中表达。

46、14.根据声明1至12中任一项所述的多核苷酸，其中具有同义密码子的序列是：

47、atgtctggtcgtaaagctcagggaaaaaccctgggcgtcaatatggtacgacgaggagttcgc(seqid no:14)

48、和

49、agcggccgcaaagcccagggtaagacactgggcgtgaacatggttcgtcgcggcgtccgg(seq idno:15)。

50、15.根据声明1至14中任一项所述的多核苷酸，其中所述黄热病病毒是yf 17d减毒病毒。

51、16.根据声明1至15中任一项所述的多核苷酸，其是细菌人工染色体。

52、17.根据声明16所述的多核苷酸，其中所述bac包含用于将所述bac扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列以及病毒表达盒，该病毒表达盒包含所述多核苷酸的cdna并包含用于在哺乳动物细胞中转录所述病毒cdna和用于将转录的rna加工成感染性rna病毒的顺式调节元件。

53、18.根据声明1至17中任一项所述的多核苷酸，其中所述t细胞抗原选自由hbc核心抗原、ova和ebna1组成的组。

54、19.根据声明1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的t细胞抗原包含seqid no：3的氨基酸序列或其包含t细胞表位的片段。

55、20.根据声明1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的t细胞抗原包含seqid no：7的氨基酸序列或其包含t细胞表位的片段。

56、21.根据声明1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的t细胞抗原包含seqid no：10的氨基酸序列或其包含t细胞表位的片段。

57、22.根据声明1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的t细胞抗原包含seqid no：13的氨基酸序列。

58、23.一种黄病毒融合构建体，其特征在于所述黄病毒在其氨基末端前面是：

59、-黄病毒衣壳蛋白的部分，其包含黄病毒衣壳蛋白的n末端部分或由黄病毒衣壳蛋白的n末端部分组成，

60、-免疫原性蛋白质，或其包含免疫原性肽的部分，以及

61、-2a切割肽。

62、为了疫苗接种的目的，这些黄病毒通常是活的感染性减毒病毒。

63、24.根据声明23所述的黄病毒融合构建体，其中所述黄病毒衣壳蛋白的部分包含黄病毒衣壳蛋白的21个n末端氨基酸或由黄病毒衣壳蛋白的21个n末端氨基酸组成。

64、25.根据声明23或24所述的黄病毒融合构建体，其中所述黄病毒是黄热病病毒。

65、26.根据声明23、24或25所述的黄病毒融合构建体，其中黄热病病毒衣壳的末端部分由序列msgrkaqgktlgvnmvrrgvr(seq id no：2)组成。

66、27.根据声明23至25中任一项所述的多核苷酸，其中所述2a切割肽包含序列dxexnpgp[seq id no：46]。

67、28.根据声明23至26中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2a切割肽包含序列lxxxgdvexpgp[seq id no：17]

68、29.根据声明23至28中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2a切割肽包含序列lltcgdveenpgp[seq id no：18]。

69、30.根据声明23至28中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2a切割肽是具有氨基酸序列egrgslltcgdveenpgp(seq id no：16)的thosea asigna 2a肽。

70、31.根据声明23至30中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2a切割肽的c末端氨基酸是gly、ala、ser或thr。

71、32.根据声明23至31中任一项所述的黄病毒融合构建体多核苷酸，其中所述免疫原性蛋白质是t细胞抗原且其免疫原性片段包含t细胞表位。

72、33.根据声明23至32中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述黄热病病毒是yf 17d减毒病毒。

73、34.根据声明23至32中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述免疫原性蛋白质选自由hbc核心抗原、ova和ebna1组成的组。

74、35.根据声明23至32中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中hbc抗原包含seq idno：7的氨基酸序列或其包含t细胞表位的片段。

75、36.根据声明1至22中任一项所述的多核苷酸，其用作疫苗。

76、37.根据声明36的用作疫苗的多核苷酸，其预防由所述免疫原性蛋白质或其免疫原性肽片段引起的感染。

77、38.根据声明36的用作疫苗的多核苷酸，其同时预防由所述免疫原性蛋白质或其免疫原性肽片段引起的感染和黄病毒感染。

78、39.根据声明23至35中任一项所述的黄病毒融合构建体，其用作疫苗。

79、40.根据声明39的用作疫苗的黄病毒融合构建体，其预防由所述免疫原性蛋白质或其免疫原性肽片段引起的感染。

80、41.根据声明40的用作疫苗的黄病毒融合构建体，其同时预防由所述免疫原性蛋白质或其免疫原性肽片段引起的感染和黄病毒感染。

81、42.根据声明40的用作疫苗的黄病毒融合构建体，其同时预防由所述t细胞抗原或部分t细胞表位引起的感染和黄热病感染。

82、43.一种药物，其包含根据声明1至22中任一项所述的多核苷酸和药学上可接受的载体。

83、44.一种药物，其包含根据声明23至35中任一项所述的黄病毒融合构建体和药学上可接受的载体。

84、45.一种制备针对免疫原性蛋白质或其肽片段的疫苗的方法，其包括以下步骤：

85、(a)提供一种bac，其包含用于将所述bac扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列，以及

86、病毒表达盒，其包含根据声明1至22中任一项所述的多核苷酸的cdna，并包含用于在哺乳动物细胞中转录所述cdna和用于将转录的rna加工成感染性rna病毒的顺式调节元件

87、(b)用步骤(a)所述的bac转染哺乳动物细胞

88、(c)验证步骤(b)的转染细胞所复制的病毒的毒力和产生针对所述t细胞抗原的抗体的能力，将步骤(c)中验证的病毒克隆到载体中，

89、将所述载体配制成疫苗制剂。

90、46.根据声明45所述的方法，其中所述载体是bac，其包含用于将所述bac扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列。

91、47.一种引发对免疫原性蛋白质的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用有效量的根据声明1至22中任一项所述的多核苷酸或根据声明23至35中任一项所述的黄病毒融合构建体。