一种报告基因修饰的干细胞及其制备方法和脑内示踪应用

本发明属于核医学分子影像领域，具体而言，涉及一种报告基因修饰的干细胞及其制备方法和脑内示踪应用。

背景技术：

1、干细胞移植已经成为许多中枢神经系统疾病(如缺血性脑卒中、帕金森病)治疗的一种潜在新策略。但是目前，我们对脑内移植干细胞的生物学行为(存活、增殖、迁移等)和安全性的认识仍然不足，而活体水平研究缺乏以及临床-基础研究脱节是制约干细胞应用临床转化的一大因素。因此，移植干细胞动态活体示踪对于推动神经系统疾病干细胞移植疗法的进一步发展至关重要。

2、正电子发射断层显像(positron emission tomography,pet)是一种先进的核医学分子影像方法，能够在细胞和分子水平上无创可视化、定性、定量生物的病理生理过程。核医学报告基因显像是一种间接的显像方法，利用编码特定酶、转运体或受体的外源性报告基因与待测目的基因同时传染靶细胞，使报告基因和目的基因编码的蛋白质共表达，即可通过核素标记“报告探针”来检测报告基因的表达情况并评价目的基因和细胞的状态。历经多年发展，pet报告基因显像方法已经成为干细胞活体示踪的重要技术。

3、但是，相比较外周的移植干细胞示踪，脑内移植干细胞示踪受血脑屏障限制因此更具挑战性。目前，可用于中枢神经系统的报道基因体系相当缺乏，现有报道基因多由于各种原因不适合神经系统研究，如hsv1-tk报道基因缺乏可穿透血脑屏障的pet探针，多巴胺2型受体(d2r)报道基因在基底节区高表达，生长抑素2型受体(sstr2)未在神经系统中验证应用。

4、酪氨酸酶(tyr)是一种调控黑色素生成的限速酶，其转染表达能够驱动细胞产生黑色素。课题组前期研究发现，tyr和黑色素靶向探针18氟-吡啶酰胺-苯甲酰胺(18f-fpabza)可作为报告基因体系在神经系统应用。

5、基于上述背景，干细胞活体示踪是推动干细胞研究进一步发展和临床转化的重要方向，本发明由此提出一种报告基因修饰的干细胞及其脑内示踪方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种报告基因修饰的干细胞及其制备方法和脑内示踪应用。

2、本发明通过以下技术方案用于实现活体分子影像的脑内移植干细胞示踪目的：

3、一种报告基因修饰的干细胞的制备方法，包括：构建过表达酪氨酸酶(tyr)报道基因的工具病毒载体；利用工具病毒载体在干细胞中表达tyr报道基因。

4、所构建的干细胞，其tyr报道基因在细胞中催化酪氨酸经多步反应成为黑色素；由此可通过pet分子影像检测黑色素以实现活体示踪脑内移植的干细胞。

5、作为一个实施方案，所述工具病毒载体包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒中的一种。

6、作为一个实施方案，所述酪氨酸酶报道基因在细胞中的表达通过组成型启动子驱动，组成型启动子选自cmv启动子、ef1a启动子、efs启动子、cag启动子、cbh启动子、sffv启动子；sv40启动子、ubc启动子、ubi启动子、hpgk启动子、β-actin启动子。

7、作为一个实施方案，所述酪氨酸酶的基因序列如序列1所示。

8、作为一个实施方案，所述酪氨酸酶的氨基酸序列如序列2所示。

9、作为一个实施方案，所述工具病毒载体表达荧光蛋白基因，包括但不限于gfp、rfp、bfp、egfp、mcherry、mstrawberry、mapple、mruby或eosfp。

10、作为一个实施方案，所述pet分子影像探针为18f-fpabza。

11、作为一个实施方案，在所述工具病毒载体中携带嘌呤霉素抗性基因，使酪氨酸酶和酪氨酸酶抗性基因同步表达，便于体外实验中细胞转染后通过嘌呤霉素筛选得到表达酪氨酸酶的细胞。

12、一种活体脑内示踪注射剂，包括本发明提供的表达tyr报告基因修饰的干细胞，通过直接注射移植进入脑组织，可在脑内移植后可通过18f-fpabza pet分子影像进行活体示踪。

13、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

14、1、本发明提供的报告基因修饰的干细胞能够在脑内移植后实现长期示踪，通过工具病毒载体可将tyr报告基因整合入干细胞的基因组中，报告基因可在子代细胞中持续表达，不随分裂而出现信号稀释。

15、2、本发明提供的干细胞或注射剂，通过结合pet分子影像探针18f-fpabza，实现脑内示踪，其具备良好的血脑屏障穿透能力，无需额外物理或化学操作(如超声微泡、小分子药物)开放血脑屏障。

技术特征：

1.一种报告基因修饰的干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法为：构建过表达酪氨酸酶(tyr)报道基因的工具病毒载体；利用工具病毒载体在干细胞中表达tyr报道基因。

2.根据权利要求1所述的一种报告基因修饰的干细胞的制备方法，其特征在于，所述工具病毒载体为慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒中的一种。

3.根据权利要求2所述的一种报告基因修饰的干细胞的制备方法，其特征在于，所述工具病毒载体携带组成型启动子，所述组成型启动子选自cmv启动子、ef1a启动子、efs启动子、cag启动子、cbh启动子、sffv启动子，sv40启动子、ubc启动子、ubi启动子、hpgk启动子、β-actin启动子。

4.根据权利要求2所述的一种报告基因修饰的干细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒载体还表达嘌呤霉素抗性基因用于筛选体外成功转染细胞。

5.根据权利要求1所述的一种报告基因修饰的干细胞的制备方法，其特征在于，所述工具病毒载体表达tyr报道蛋白的基因序列包括如序列1所示序列。

6.根据权利要求1所述的一种报告基因修饰的干细胞的制备方法，其特征在于，所述工具病毒载体还表达荧光蛋白基因，所述荧光蛋白基因选自gfp、rfp、bfp、egfp、mcherry、mstrawberry、mapple、mruby或eosfp。

7.权利要求1-6任一项所述制备方法制备的报告基因修饰的干细胞。

8.权利要求7所述的报告基因修饰的干细胞的应用，其特征在于，用于制备脑内移植干细胞的活体示踪试剂，该试剂结合pet探针18氟-吡啶酰胺-苯甲酰胺(18f-fpabza)，用于干细胞内tyr催化的黑色素的检测，实现活体脑内示踪。

技术总结
本发明公开一种报告基因修饰的干细胞及其制备方法及脑内示踪应用。本发明构建的干细胞系能够稳定表达酪氨酸酶(TYR)报告基因，酪氨酸酶能够在细胞中催化酪氨酸发生多步反应合成黑色素，使用靶向黑色素的核素标记探针<supgt;18</supgt;氟‑吡啶酰胺‑苯甲酰胺(<supgt;18</supgt;F‑FPABZA)，能够有效穿透血脑屏障靶向黑色素实现脑内移植干细胞的活体示踪。该系统的构建为再生医学和干细胞移植治疗研究提供了一种有效的研究工具。

技术研发人员：田梅,张宏,金晨涛,钟燕,周瑞,张晓辉,王菁,罗晓芸
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25