一种浓缩真菌蛋白、其制备方法及其在细胞培养肉中的应用

本发明属于微生物领域和食品领域，具体涉及一种浓缩真菌蛋白、其制备方法及其在细胞培养肉中的应用。

背景技术：

1、为缓解动物蛋白生产面临的环境资源压力，解决人口增长可能导致的动物蛋白供应缺口，近年来，全球对动物替代蛋白的需求呈持续上升趋势。通过微生物发酵方式获得的真菌蛋白，生产方式环境友好，氨基酸组成均衡，不含异味，在替代蛋白行业表现出众。其中，镰刀真菌蛋白是最具代表性的真菌蛋白，早已成为人造肉品牌quorntm产品的蛋白原料，其生产应用在国内也开始受到关注。如中国科学院天津工业生物技术研究所从土壤中筛选获得优化发酵条件下蛋白含量达到55％的镰刀菌tb01(cn112226373b)。但其中中所用镰刀菌菌株为fusarium venenatumtb01，优化培养基或发酵条件下的蛋白质含量不到60％，与常用的蛋白原料工业级大豆浓缩蛋白70％的蛋白质含量以及大豆分离蛋白90％的蛋白质含量仍有差距，限制了其在一些需要高蛋白质含量的替代蛋白产品中的应用。

2、细胞肉通过体外培养动物细胞的方式生产可供食用的动物组织，由于营养、外观、质构和味道更加接近真实肉制品，在环境资源保护、动物福利、公共健康等方面也具有较大优势，是未来人造肉的主要研究发展方向。细胞培养肉产业化的关键在于实现种子细胞的大规模培养。因此，提高种子细胞的贴附、增殖、迁移和分化能力对于细胞培养肉至关重要。如江南大学利用铁离子修饰获得细胞贴附性能增强的微载体(cn113549590 b)，可适用于动物细胞高密度大规模培养。浙江大学利用来自米糠、小麦麸皮、玉米种皮等的纤维质与海藻酸钠、明胶等水凝胶前驱体制备支架，可以诱导细胞迁移，提高细胞增殖效率(cn116790484 a)。杭州极麋生物科技有限公司制备了一种扁豆蛋白提取物，以增加牛脂肪间充质干细胞的细胞增殖速率(cn116590228a)。南京农业大学开发了应用于成脂干细胞培养的植物拉丝蛋白支架，制备一种具有动物肉风味的植物基脂肪培养肉(cn114736851 a)。

3、肌肉干细胞是培养肉生产中最具有潜力的种子细胞(胡荣蓉，丁世杰，郭赟等.trolox对猪肌肉干细胞增殖及分化的影响[j].中国农业科学,2021,54(24):5290-5301.)。贴壁生长是肌肉干细胞重要的生理特性。在生物反应器中进行肌肉干细胞大规模、高密度培养，需使用细胞载体支架材料，模拟自然组织中细胞外基质的结构和环境，为细胞提供充足的附着表面、生长空间及稳定的力学支撑。可食用的细胞载体支架材料及其制造技术成为细胞培养肉领域的研究热点。除对细胞附着、扩增的影响需考虑外，细胞载体支架最好还有可降解或可食用等特殊要求，否则培养完成后还需额外的分离步骤，增加工艺的复杂程度和生产成本(李鑫,彭常安,许月明等.细胞支架与组织成型技术在细胞培养肉中的应用[j].武汉轻工大学学报,2023,42(02):52-60.李雪良,张国强,赵鑫锐等.细胞培养肉规模化生产工艺及反应器展望[j].过程工程学报,2020,20(01):3-11.)。动物源蛋白包括胶原蛋白、明胶等是最为常见的载体支架材料，然而大量提取动物源材料用于培养肉的商业化生产，与培养肉的开发初衷相悖。因此，开发非动物源的材料成为细胞载体支架研究的热点方向之一。植物蛋白因来源广、成本低，安全无毒可食用，成为培养肉载体支架开发的重要来源(张璨,施李杨,戴建武.细胞培养肉用生物材料的设计[j].合成生物学,2022,3(04):676-689.)。用于细胞载体支架制备的植物蛋白主要包括大豆蛋白和玉米蛋白。如以色列理工学院的levenberg教授课题组以商业化大豆组织蛋白，作为细胞培养肉多孔支架，牛肌肉干细胞能在该支架上黏附和增殖(ben-arye t,shandalov y,ben-shaul s,etal.textured soy protein scaffolds enable the generation of three-dimensionalbovine skeletal muscle tissue for cell-based meat[j].nature food,2020,1(4):210-220.)又如玉米醇溶蛋白可溶于乙醇，可通过静电纺丝技术制备形成纳米纤维，肌细胞在纤维表面的附着和增殖能力增强(wang hj,lin zx,liu xm,sheng sy,wangjy.heparin-loaded zein microsphere film and hemocompatibility[j].journal ofcontrol release.2005,105(1-2):120-31.)。

4、真菌蛋白为非动物来源蛋白质，氨基酸组成比大豆蛋白更加接近动物蛋白，生产不依赖于土地气候，不存在动物福利伦理争论，如果真菌蛋白能够促进细胞培养肉种子细胞的贴附、增殖、迁移，其在细胞培养肉中的应用对降低细胞培养肉的生产成本，提高细胞培养肉的产品质量具有重要意义。然而，由于目前的发酵真菌蛋白的蛋白含量相对低，含有大量纤维，水溶性差，尚未发现发酵真菌蛋白以及浓缩发酵真菌蛋白通用于细胞培养肉的相关专利。

技术实现思路

1、针对浓缩真菌蛋白制备及其在细胞培养应用领域研究空白的现状，本发明以镰刀菌发酵真菌蛋白为原料，通过碱化高压均质联合等电点沉淀方法制备浓缩真菌蛋白，碱化高压均质能有效瓦解镰刀菌发酵真菌蛋白的紧密结构，破坏蛋白质与纤维的结合，获得的高蛋白质含量、支链氨基酸丰富的浓缩真菌蛋白具有促进肌肉干细胞贴附、增殖、迁移的功能，在细胞培养肉中可以取代胶原蛋白或明胶，降低细胞培养肉种子细胞大规模生产的培养成本。

2、本发明首先提供一种镰刀菌浓缩真菌蛋白的制备方法，其包括如下步骤：

3、s1原料镰刀菌发酵真菌蛋白与水混合得到混合体系；

4、s2对s1的混合体系进行碱化；

5、s3对经碱化处理的混合体系进行高压均质；

6、s4对高压均质后获得的上清液进行等电点沉淀，获得镰刀菌浓缩真菌蛋白。

7、优选地，s1中原料镰刀菌发酵真菌蛋白与水混合得到混合体系，混合体系中的真菌蛋白用量按干重计为2％至10％；

8、另外优选地，s2中所述碱化中使用的碱化剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾中的一种或几种，优选地，碱化剂用量以其调整的所述混合体系ph至9至11来计量。

9、在具体实施方式中，s3中所述高压均质处理中使用的高压均质压力为40mpa至300mpa，具体地所述高压均质处理次数为1至5次。

10、在优选实施方式中，s4所述等电点沉淀是在高压均质处理后的混合体系经离心或过滤操作进行固液分离获得上清液后进行，其中使用的酸化剂用量以其调整所述上清液ph至3至5为计量；

11、具体地，在进行固液分离之前，于20℃至80℃下搅拌放置0.5h至4h后，通过离心或过滤操作进行固液分离获得上清液后，再进行等电点沉淀；

12、所述等电点沉淀是在所述上清液加入酸化剂进行静置，所述酸化剂选自盐酸、柠檬酸、醋酸中的一种或几种；

13、所述等电点沉淀处理中的酸化剂作用时间为1h至12h。

14、本发明进而提供所述的制备方法得到的镰刀菌浓缩真菌蛋白。

15、本发明还提供所述的镰刀菌浓缩真菌蛋白在制备细胞培养用的载体或支架中的应用。

16、相应提供一种用于细胞培养的载体或支架，其是通过将所述浓缩真菌蛋白包被涂层或纺丝成膜的方式加工成型得到的，优选地，包被涂层的制备方式如下：使用缓冲液配制浓缩真菌蛋白溶液加入至培养载体如培养板中，放置后吸取多余液体,培养板充分干燥，使用紫外照射过夜灭菌即得包被了制浓缩真菌蛋白的培养板；

17、纺丝成膜的制备方式如下：配置浓缩真菌蛋白的六氟异丙醇溶液，加入注射器后，将针管夹在推料装置上，将电线夹在针头上，启动静电纺丝机，电纺后样品真空干燥过夜，即得浓缩真菌蛋白纺丝成膜的细胞培养支架。

18、本发明进一步提供所述的用于细胞培养的培养载体或支架在培养种子细胞肌肉干细胞中的应用。

19、具体地，所述种子细胞包括猪成肌干细胞、牛成肌干细胞、羊成肌干细胞、鸡成肌干细胞中的一种或几种。

20、本发明的有益效果在于：

21、一是尽管在进化菌株与优化培养条件下，镰刀菌真菌蛋白的蛋白质含量能达到60％，但其与植物蛋白肉常用的蛋白原料工业级大豆浓缩蛋白的70％的蛋白质含量以及大豆分离蛋白的90％的蛋白质含量仍有差距，限制了其在一些需要高蛋白质含量的替代蛋白产品中的应用。因此，在通过发酵获得真菌蛋白后利用后续工艺制备蛋白质含量超过70％的浓缩蛋白对拓展镰刀菌真菌蛋白的替代蛋白价值具有重要意义。

22、二是真菌蛋白为非动物来源蛋白质，不存在动物福利伦理争论，其生产不依赖于土地气候，生产效率高于植物蛋白。而本发明通过研究表明，所获得的浓缩真菌蛋白的支链氨基酸(亮氨酸+异亮氨酸+缬氨酸)含量高，在氨基酸中的占比超过20％。最终研究表明其能够促进细胞培养肉种子细胞的贴附、增殖、迁移。而且，真菌蛋白由于含有大量不可溶纤维，在水与有机溶剂中的溶解性都差，难以加工定型。而本发明通过碱化高压均质联合等电点沉淀方法制备的浓缩真菌蛋白溶解性提高，自身就能够通过静电纺丝加工形成纳米纤维，说明浓缩真菌蛋白具有细胞支架加工成型的能力。因此，本发明在细胞培养肉中的应用对降低细胞培养肉的生产成本，提高细胞培养肉的产品质量具有重要意义。