一种野葛毛状根诱导方法

【】本发明涉及生物工程，具体涉及一种野葛毛状根诱导方法。

背景技术

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背景技术：

1、野葛puerarialobata(willd)ohwi为豆科、葛属多年生藤本植物，以块根入药。其为中国卫生部首批批准的药食同源两用植物，素有“北参南葛”、“亚洲人参”之美誉。野葛的活性成分主要包括异黄酮类、葛根苷类、萜类、生物碱及香豆素等，其中异黄酮类物质是葛根的主要活性成分，该类化合物主要包括葛根素、大豆苷元、大豆苷等。葛根素是野葛含量最高的次生代谢物，也是最早从野葛的根中分离鉴定的有效成分；而其他成分如大豆苷、大豆苷元、刺芒柄花素和木苷也广泛分布于野葛中。

2、野葛的药用价值早在汉代的《神农本草经》中就有较详细的记载。中医认为：葛根味甘辛、性凉、归脾胃经、属发散风热药，具解肌、透发斑疹、升阳止泻的功效。近代医学研究表明，野葛在降血压、改善心脑血管循环、调节血糖、抗癌、防止骨质疏松等方面发挥重大作用。

3、发根农杆菌是根瘤菌科的一种革兰氏阴性土壤杆菌，可以将ti质粒中携带的外源基因通过植物的伤口处快速插入并整合到宿主的核dna中，使植物合成冠瘿碱(opine)后产生许多不定根，这种不定根生长迅速并不断分支成毛状，故称之为发根或毛状根，同时发根农杆菌能够将携带的外源基因共同整合到植物基因组中实现共转化。毛状根诱导体系的高效建立不仅为葛根基因功能研究提供高效、快速的研究手段，同时也为葛根素等次生代谢产物的工业化生产奠定了技术基础。

4、植物基因型的依赖性是当前公认的影响农杆菌转化效率的主要限制因素，目前转化效率较高的植物主要集中在茄科、菊科、十字花科及旋花科等，而具籽粒豆的豆科植物，则是较难转化的植物，目前豆科植物中仅大豆建立了较为成熟的毛状根遗传转化体系。常见的葛属中，粉葛未见有毛状根诱导的相关报道，现有野葛的毛状根诱导率和遗传转化效率也偏低。因此，建立一套高效的野葛毛状根诱导体系对野葛的功能鉴定和次生代谢产物的工厂化生产奠定了重要的技术基础。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种野葛毛状根诱导方法。本发明的诱导方法操作简单，明显提高了野葛毛状根诱导效率和共转化频率。

2、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种野葛毛状根诱导方法，包括以下步骤：

4、(1)外植体处理：取野葛组培苗刚完全展开的幼嫩叶片，放入ms固体培养基中暗培养2-3d，得叶片外植体；

5、(2)菌液活化培养：将k599发根农杆菌的菌液接种到含抗生素的yeb液体培养基中，于28℃、200r·min-1的条件下培养至其od600为0.6-0.8，于4000rpm下离心10min，收集菌体，并用yeb液体培养基重悬，调整其od600为0.5-0.7，得重悬农杆菌液；

6、(3)共培养

7、在超净工作台上，将所述叶片外植体转入所述重悬农杆菌液中，振荡培养15-20min后将所述叶片外植体取出，放置在无菌滤纸上晾干至表面没有明显菌液后转入ms固体培养基上暗培养2d；

8、(4)毛状根诱导

9、暗培养结束后，清洗所述叶片外植体的表面并用无菌滤纸吸干其表面水分，然后将其转入含cef的ms固体培养基中暗培养，且每隔7d用相同的培养基转接1次，即可诱导出毛状根；

10、(5)毛状根继代增殖

11、取诱导得到的生长状态稳定的毛状根转入ms固体培养基进行继代增殖，即可得到生长旺盛的野葛毛状根。

12、进一步的，步骤(2)中，所述抗生素为kan，其含量为50mg/ml。

13、进一步的，步骤(4)中，所述清洗包括以下步骤：先用无菌水清洗3次，每次10min；再用含头孢霉菌500mg/l的无菌水漂洗2次，每次10min。

14、进一步的，步骤(4)中，所述cef的浓度为100mg/ml。

15、进一步的，所述ms固体培养基的ph为5.8，且所述ms固体培养基中均含有30.0g/l蔗糖以及6.0g/l琼脂。

16、进一步的，步骤(1)中，所述野葛组培苗为继代培养5-13代的野葛组培苗。

17、进一步的，步骤(1)中，所述野葛组培苗为继代培养8-10d的野葛组培苗。

18、进一步的，步骤(1)中，所述幼嫩叶片为所述野葛组培苗第1-2节位的刚展开的幼嫩叶片。

19、进一步的，步骤(1)中，所述野葛组培苗的基因型为yg-19。

20、综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

21、本发明通过选用特定的外植体材料，结合特定的发根农杆菌以及简化的菌液活化操作，初步建立了发根农杆菌介导的野葛毛状根遗传转化体系，为野葛基因功能鉴定奠定基础。通过该方法，明显提高了野葛毛状根诱导效率以及野葛毛状根转化效率，诱导效率达50.0％以上，共转化频率达80％。与此同时，本发明诱导得到的野葛毛状根具有生长快速，周期短，不受季节限制，次级代谢产物相对产量高等优点，可用于工业化生产葛根素，为将来利用毛状根工业化生产野葛次级代谢产物提供了可用途径。

技术特征：

1.一种野葛毛状根诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述一种野葛毛状根诱导方法，其特征在于，步骤(2)中，所述抗生素为kan，其含量为50mg/ml。

3.根据权利要求1所述一种野葛毛状根诱导方法，其特征在于，步骤(4)中，所述清洗包括以下步骤：先用无菌水清洗3次，每次10min；再用含头孢霉菌500mg/l的无菌水漂洗2次，每次10min。

4.根据权利要求1所述一种野葛毛状根诱导方法，其特征在于，步骤(4)中，所述cef的浓度为100mg/ml。

5.根据权利要求1所述一种野葛毛状根诱导方法，其特征在于，所述ms固体培养基的ph为5.8，且所述ms固体培养基中均含有30.0g/l蔗糖以及6.0g/l琼脂。

6.根据权利要求1所述一种野葛毛状根诱导方法，其特征在于，步骤(1)中，所述野葛组培苗为继代培养5-13代的野葛组培苗。

7.根据权利要求1所述一种野葛毛状根诱导方法，其特征在于，步骤(1)中，所述野葛组培苗为继代培养8-10d的野葛组培苗。

8.根据权利要求1所述一种野葛毛状根诱导方法，其特征在于，步骤(1)中，所述幼嫩叶片为所述野葛组培苗第1-2节位的刚展开的幼嫩叶片。

9.根据权利要求1所述一种野葛毛状根诱导方法，其特征在于，步骤(1)中，所述野葛组培苗的基因型为yg-19。

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种野葛毛状根诱导方法。本发明的野葛毛状根诱导方法，包括野葛组培苗叶片的处理、发根农杆菌K599的菌液活化培养、叶片外植体和重悬农杆菌液共培养、毛状根诱导和毛状根继代增殖。本发明的诱导方法操作简单，明显提高了野葛毛状根诱导率和共转化频率。

技术研发人员：曾文丹,严华兵,尚小红,施平丽,肖亮,龙紫媛,曹升,陆柳英,李婕宇
受保护的技术使用者：广西壮族自治区农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19