用于猕猴桃细菌性溃疡病菌LAMP-LFD检测的引物探针组合、试剂盒和检测方法

本发明涉及生物，特别是涉及用于猕猴桃细菌性溃疡病菌lamp-lfd检测的引物探针组合、试剂盒和检测方法。

背景技术：

1、由pseudomonassyringaepv.actinidiae侵染引起的猕猴桃细菌性溃疡病是猕猴桃生产上的一种毁灭性病害，常造成重要损失，严重地制约了猕猴桃产业的健康发展和农民的增产增收。猕猴桃细菌性溃疡病菌的快速、准确诊断对于该病害的预测预报和适时防治至关重要。猕猴桃细菌性溃疡病菌传统鉴定检测方法主要依据病原菌的形态、生理生化特征和病原菌致病性测定及保守基因序列特异位点分析等，这些鉴定检测方法存在对专业知识要求高、操作步骤繁琐、耗时长、工作量大、准确率低及难以将相近物种或致病性亚种分开等缺点，已无法满足大批量样品高通量快速检测，常延误病害的最佳防控时间，远不能满足病害及时有效防治的需求。因此，迫切需要建立更为快捷、灵敏、准确和简便的猕猴桃细菌性溃疡病菌(p.syringaepv.actinidiae)检测技术，对于病害的早期诊断和预警、实时监测和及时防治具有重要的意义。

2、目前公开的猕猴桃细菌性溃疡病菌检测主法主要采用pcr、elisa和pra-lfd等方法，实现了实验室条件下对猕猴桃细菌性溃疡病菌简便、敏感、特异检测。基于pcr和elisa等检测方法在一定程度上克服了传统形态特征和生理生化检测的缺陷，但这些检测方法需要昂贵的pcr仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等以及复杂的分子生物学实验操作，只能在设备较为完善的实验室中应用，且需要较长的检时间，在适用性上局限性较大，难以在生产中推广使用。

3、环介导恒温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,lmap)是日本学者notomi(2000年)发明的一种核酸体外扩增技术，其反应依赖于具有链置换活性的bstdna聚合酶，基于检测对象靶标基因的6个特定区域设计4条特异性引物，在恒温条件下(63-65℃)进行靶序列高效(30-60min)且特异性快速扩增。lamp产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察和荧光染料目测观察等方法。

4、横向流动试纸条(lateral flow dipstick,lfd)是一种新的检测方法，反应中6-羧基荧光素(6-fam)标记的探针与生物素标记的lamp扩增产物特异性杂交，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。lfd检测无需特殊设备以及eb等有毒试剂，操作者只需将产物和试纸条浸入缓冲液即可，操作简便、安全。lamp-lfd结合技术的检测结果可以直接肉眼观察，lfd试纸条上有质控带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有质控带显色、检测带不显色表明检测结果为阴性。lamp-lfd结合方法安全、快捷、高效、高灵敏度具无设备及技术限制，具有其它技术所无法替代的优势。

5、目前，lamp-lfd技术已成功运用于旱稻孢囊线虫(heterodera elachista)、拟禾本科根结线虫(meloidogynegraminicola)、玉米细菌性枯萎病菌(pantoea stewartiisubsp.stewartii,pss)、猕猴桃褪绿环斑相关病毒(actinidia chlorotic ringspotsassociatedvirus,acrav)和禾谷镰孢菌(fusarium graminearum)等植物病原菌的检测，而用于猕猴桃细菌性溃疡病菌(p.syringae pv.actinidiae)的检测未见报道。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了用于猕猴桃细菌性溃疡病菌lamp-lfd检测的引物探针组合、试剂盒和检测方法，本发明应用环介导恒温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,lamp)结合色谱横向流动试纸条(lateral flow dipstick,lfd)检测猕猴桃细菌性溃疡病菌(p.syringae pv.actinidiae)，以实现对猕猴桃细菌性溃疡病菌(p.syringae pv.actinidiae)进行快速、安全、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有用pcr检测猕猴桃细菌性溃疡病菌(p.syringae pv.actinidiae)对仪器设备及操作技术要求高的问题。本发明第一次将lamp技术和lfd结合用于猕猴桃细菌性溃疡病菌(p.syringaepv.actinidiae)的检测，为猕猴桃细菌性溃疡病快速诊断和监控提供了技术支撑。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种用于猕猴桃细菌性溃疡病菌lamp-lfd检测的引物探针组合，包括fip引物、bip引物、f3引物、b3引物和ps-hp探针；

4、所述fip引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；

5、所述bip引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；

6、所述f3引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；

7、所述b3引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；

8、所述ps-hp探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。

9、优选的，所述fip引物的5'端使用生物素标记，所述ps-hp探针的5'端使用6-羧基荧光素标记。

10、本发明还提供了上述技术方案所述的引物探针组合在诊断和/或检测猕猴桃细菌性溃疡病菌中的应用。

11、本发明还提供了一种用于猕猴桃细菌性溃疡病菌lamp-lfd检测的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物探针组合。

12、优选的，还包括反应缓冲液和bst dna聚合酶。

13、优选的，所述反应缓冲液的组分包括dntps、tris-hcl、kcl、mgso4、(nh4)2so4和triton x-100。

14、本发明还提供了一种基于lamp-lfd检测猕猴桃细菌性溃疡病菌的方法，包括以下步骤：

15、1)提取样品的基因组dna，以所述基因组dna为模板，使用上述技术方案中的fip引物、bip引物、f3引物、b3引物进行lamp扩增，得到扩增产物；

16、2)将所述步骤1)得到的扩增产物与上述技术方案中的ps-hp探针混合、杂交反应，得到杂交液；

17、3)将所述步骤2)得到的杂交液与buffer缓冲液混合，得到混合液；

18、4)将lfd试纸条浸入到步骤3)得到的混合液中，当质控带和检测带均显色时，表示样品中含有猕猴桃细菌性溃疡病菌。

19、优选的，所述步骤1)lamp扩增的体系每25μl含有：f3引物和b3引物各0.2μmol/l，fip引物和bip引物各1.6μmol/l，dntps 0.96mmol/l，ph值为8.8的tris-hcl 20mmol/l，kcl10mmol/l，mgso4 mmol/l，(nh4)2so410mmol/l，0.1％triton x-100，8u bst dna聚合酶和1μl基因组dna，ddh2o补充至25μl；

20、所述lamp扩增的条件为：温度为63.5℃，时间为45min。

21、优选的，每25μl体系使用20pmolps-hp探针；

22、所述杂交反应的条件为：温度为63.5℃，时间为5min。

23、优选的，所述步骤3)杂交液与buffer缓冲液的体积比为1:9。

24、本发明的有益效果为：

25、与现有的猕猴桃细菌性溃疡病菌检测技术相比，本发明所提供的猕猴桃细菌性溃疡病菌(p.syringae pv.actinidiae)的lamp-lfd检测方法具有如下优点：

26、1、灵敏度高，对猕猴桃细菌性溃疡病菌(p.syringaepv.actinidiae)的检测极限可低至7.0cfu/ml10 fg/μl，其检测灵敏度比常规pcr和lamp-age的高100倍。

27、2、特异性强，针对猕猴桃细菌性溃疡病菌(p.syringaepv.actinidiae)的hrpw基因中的6个不同区域设计4条特异性，并且还有1条特异性dna探针，特异性比常规pcr要强。

28、3、检测时间短，1h左右可获得检测结果，比常规pcr检测节省2-4h。

29、4、仪器设备要求低，不需pcr所用的pcr仪、凝胶电泳和成像系统等昂贵设备，只需一台普通水浴锅即可完成检测。

30、5、操作简单、检测结果直观准确，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作，检测如果清晰明显具可视化，直接肉眼观察即可判断，若条件有限，可不需要繁琐的电泳和紫外观察。

31、综上所述，本发明具有比现有的猕猴桃细菌性溃疡病菌(p.syringaepv.actinidiae)检测方法具有更高的特异性、灵敏度和便捷(携)性，并且可以在实际生产中现场应用检测，可应用于田间猕猴桃细菌性溃疡病发病早期快速分子检测，有利于控制猕猴桃细菌性溃疡病的流行暴发，具有较高的实际应用价值。