用于鼻疽伯克霍尔德氏菌检测的CRISPR-Cas12a引物组及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及用于鼻疽伯克霍尔德氏菌的crispr-cas12a检测特异性靶标序列、引物组及其应用，更加具体的涉及用于鼻疽伯克霍尔德氏菌检测靶标序列和crispr-cas12a检测用引物、crrna及其用途。

背景技术：

1、鼻疽伯克霍尔德氏菌(burkholderia mallei)是一种杆菌，属于伯克霍尔德菌属，主要寄生于马和驴，是引起马鼻疽的病原菌，可通过接触、呼吸道和消化道传播至人而致病。鼻疽伯克霍尔德氏菌对人类主要危险性在于感染剂量低、高致病性和死亡率、多重耐药以及容易气溶胶化。一旦感染，病情往往较为严重，感染后不及时治疗可出现难治性肺炎、坏疽及致死性败血症，死亡率高达90％以上。鼻疽伯克霍尔德氏菌曾用作生物武器，被认为是生物恐怖袭击的病原体。鼻疽伯克霍尔德氏菌呈全球分布，美国等发达国家通过严格的病畜强制宰杀基本根除了鼻疽，但在亚洲、中东、南美洲和非洲等许多国家地区仍有散发病例。经典的鼻疽伯克霍尔德氏菌检测方法，包括分离培养、pcr技术、全基因组和宏基因组测序等，这些方法虽然在检测鼻疽伯克霍尔德氏菌方面起着重要作用，但同时具有费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高、不适于临场快速检测等问题。因此，无论是预防还是治疗，都需要开发一种快速、灵敏和特异的方法来检测鼻疽伯克霍尔德氏菌。

2、crispr-cas技术是近年来发展迅猛的基因编辑技术，成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr)及其相关蛋白(crispr-associated proteins,cas)构成crispr-cas系统。crispr-cas系统原本是存在于原核生物体内的一种适应性免疫机制。目前，经过一系列的改造，crispr-cas技术已在基因组编辑、基因表达调控、基因治疗、病原体检测、靶基因高通量筛选、表观遗传修饰等多个生命科学的研究领域被广泛应用。除了作为基因编辑工具，ⅱ类cas蛋白如cas12a蛋白具有的“附属切割”特性，已被开发成识别不同类型靶标的核酸检测方法，在快速检测领域具有重大潜力。

3、重组酶聚合酶恒温扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)是一种等温扩增新技术，广泛用于病原菌核酸分子诊断。其在国内基于开发的公司及使用酶来源等的差异，又被命名为重组酶介导等温扩增技术(recombinase aidedamplification，raa，江苏奇天基因生物科技有限公司、杭州众测生物科技有限公司)或酶促恒温扩增技术(enzymatic recombinase amplification，era，苏州先达基因科技有限公司)等。raa用三种核心酶替代了聚合酶链式反应(pcr)所需的热循环。不同于许多其他等温技术，raa省去了升高或精确控温阶段，扩增反应在25～42℃的温度范围内均可进行，反应通常在5～15min内完成。raa技术自一出现就崭露头角，因其具有反应迅速(5～15min)、特异性强(引物)、低温运行(25～42℃)、样本容差(对样本类型的要求特别宽松)、灵敏度高(单拷贝)、适用性广、试剂形态灵活(液态试剂或干粉)和检测形式多样等优势，在核酸检测领域得到了广泛应用。

4、将crispr-cas12a检测系统与raa技术结合，通过raa技术常温扩增目的片段，然后进行crispr-cas12a检测反应，此结合的意义在于raa预先扩增可以弥补crispr-cas12a检测灵敏度不高的缺陷，同时利用crispr-cas12a检测的特异性保证检测结果的准确性，达到优势互补，提高检测效果的目的。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于鼻疽伯克霍尔德氏菌核酸检测的特异性靶标序列以及靶向该序列的crispr检测引物和crrna，将此引物组及crrna用于基于crispr技术的基因检测中可快速现场检测鼻疽伯克霍尔德氏菌，具有特异性好，灵敏度高，简易的优点。

2、第一方面，本发明提供了一种用于检测鼻疽伯克霍尔德氏菌核酸的靶标序列；

3、所述鼻疽伯克霍尔德氏菌的靶标序列为鼻疽伯克霍尔德氏菌的seq id no.1所示的nw91_03160基因。

4、第二方面，本发明提供了一种用于检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的靶向上述特异性靶标序列的crispr-cas12a系统，包括cas12a蛋白和crrna，或二者形成的复合体；

5、所述crrna包括用于与cas12a蛋白结合的锚定序列和靶向鼻疽伯克霍尔德氏菌靶标序列的向导序列；

6、上文所述crispr-cas12a系统中，所述crrna中，所述锚定序列可为seq id no.13的第1-21位，所述向导序列可为seq id no.13的第22-43位。具体地，所述crrna的序列为seq id no.13；

7、或，所述cas12a蛋白为lbcas12a蛋白。

8、第三方面，本发明提供了一种用于检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的试剂盒，其包括如下：

9、1)第二方面中所述用于检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的crispr-cas12a系统；

10、2)用于特异性扩增第一方面中所述鼻疽伯克霍尔德氏菌靶点序列的raa扩增引物；

11、3)作为荧光报告分子的探针；

12、所述探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。

13、上文所述试剂盒中，所述raa引物对为能够以鼻疽伯克霍尔德氏菌基因组为模板扩增得到seq id no.1的第375-560位所示dna片段的引物对。

14、所述raa扩增引物由seq id no.3所示的单链dna分子和seq id no.10所示的单链dna分子组成；

15、在本发明的具体实施方式中，所述探针的荧光报告基团具体为fam，荧光淬灭基团具体为bhq1。所述探针为：5`6-fam-tttttttttttt-bhq1-3’。

16、进一步地，所述试剂盒还可含有如下中的全部或部分：能结合单链核酸的重组酶、单链dna结合酶、链置换型dna聚合酶、dntps和醋酸镁。

17、进一步地，所述试剂盒还可含有阳性参考质粒。

18、更进一步地，所述阳性参考质粒可为含有seq id no.1所示dna片段的质粒，具体为将seq id no.1所示dna片段克隆到puc57载体后得到的重组质粒。

19、第四方面，本发明提供了如下任一物质：

20、a1)第一方面中的所述的靶标序列；

21、a2)第二方面中的所述的crrna；

22、a3)第二方面中的所述的cas12a蛋白和crrna，或者二者形成的复合体；

23、a4)第三方面中的所述的raa扩增引物；

24、a5)第三方面中的所述探针。

25、本发明所提供的序列为seq id no.1所示核苷酸序列。该序列特异性存在于鼻疽伯克霍尔德氏菌基因组，且在菌株间高度保守，但不存在于伯克霍尔德菌属的其他近缘物种基因组中。

26、第五方面，本发明提供了如下任一应用：

27、b1)第二方面中所述的系统或第三方面中所述的试剂盒或第四方面中所述的物质在检测或辅助检测鼻疽伯克霍尔德氏菌或其核酸中的应用；

28、b2)第二方面中所述的系统或第三方面中所述的试剂盒或第四方面中所述的物质在制备检测或辅助检测鼻疽伯克霍尔德氏菌或其核酸的产品中的应用；

29、b3)第二方面中所述的系统或第三方面中所述的试剂盒或第四方面中所述的物质在检测或辅助检测待测样本中是否含有鼻疽伯克霍尔德氏菌或其核酸中的应用；

30、b4)第二方面中所述的系统或第三方面中所述的试剂盒或第四方面中所述的物质在制备检测或辅助检测待测样本中是否含有鼻疽伯克霍尔德氏菌或其核酸的产品中的应用；

31、b5)第二方面中所述的系统或第三方面中所述的试剂盒或第四方面中所述的物质在诊断或辅助诊断待测样本中是否感染鼻疽伯克霍尔德氏菌中的应用；

32、b6)第二方面中所述的系统或第三方面中所述的试剂盒或第四方面中所述的物质在制备诊断或辅助诊断待测样本中是否感染鼻疽伯克霍尔德氏菌的产品中的应用；

33、b7)第二方面中所述的系统或第三方面中所述的试剂盒或第四方面中所述的物质在筛选或辅助筛选鼻疽伯克霍尔德氏菌防治药物中的应用；

34、b8)第二方面中所述的系统或第三方面中所述的试剂盒或第四方面中所述的物质在制备筛选或辅助筛选鼻疽伯克霍尔德氏菌防治药物的产品中的应用；

35、b9)第四方面中所述的物质在制备第三方面所述试剂盒中的应用；

36、b10)seq id no.1所示的dna分子作为检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的靶基因在检测或辅助检测鼻疽伯克霍尔德氏菌或其核酸中的应用；

37、b11)seq id no.1所示的dna分子作为检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的靶基因在制备检测或辅助检测鼻疽伯克霍尔德氏菌或其核酸的产品中的应用。

38、第六方面，本发明提供了一种检测或辅助检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的方法，包括如下步骤：

39、c1)以待测样本的核酸为模板，采用第三方面中所述的raa扩增引物进行raa扩增，得到raa产物；

40、c2)配制含有如下组分的crispr-cas12a检测体系：所述raa产物、第二方面所述的cas12a蛋白、第二方面中所述的crrna、crispr反应缓冲液和第三方面中所述探针；同时以水替代所述raa产物作为阴性对照；

41、c3)将所述crispr-cas12a检测体系反应，检测反应产物，从而判断待测样本是否含有鼻疽伯克霍尔德氏菌。

42、上文所述方法中，步骤c1)中，所述raa扩增的反应条件为：35-41℃反应20-40分钟。在本发明的实施例中具体为raa扩增时的反应温度为39℃，反应时间30min。

43、或，步骤c2)中，所述crispr反应的条件为35-39℃下反应10-30分钟。在本发明的实施例中具体crispr反应时的反应温度为37℃，反应时间20min。

44、上文所述方法中，所述检测反应产物的方法如下任一种：

45、1)荧光检测仪检测信号，根据所述检测信号确定检测结果；

46、若反应产物的荧光量小于或等于阴性对照荧光量的2倍，则待测样本不含有或候选不含有鼻疽伯克霍尔德氏菌或其核酸；

47、若反应产物的荧光量大于阴性对照荧光量的2倍，则待测样本含有或候选含有鼻疽伯克霍尔德氏菌或其核酸。

48、上述阴性对照组为每个实验组对应设置的以加入水或者其他非鼻疽伯克霍尔德氏菌dna(如水)作为模板的阴性对照。

49、2)通过便携式荧光手电筒进行肉眼可视化荧光判断检测结果。

50、所用荧光手电筒的荧光发射波长为440-460nm。

51、若反应产物发荧光，则待测样本含有或候选含有鼻疽伯克霍尔德氏菌或其核酸；

52、若反应产物不发荧光，则待测样本不含有或候选不含有鼻疽伯克霍尔德氏菌或其核酸。

53、进一步地，所述阴性信号组可以以水替代模板。

54、上文中检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的应用为非疾病诊断治疗性应用，上文中检测鼻疽伯克霍尔德氏菌的方法为非疾病诊断治疗性方法；具体地，应用和方法目的是用于鼻疽伯克霍尔德氏菌药物模型的制备或者用于筛选鼻疽伯克霍尔德氏菌治疗药物。

55、本发明所提供的引物及crrna涉及医用检查检验仪器及服务中的体外诊断用试剂，是针对鼻疽伯克霍尔德氏菌的特异性基因nw91_03160进行设计的，且利用crispr(cluste redregularly interspaced short palindromic repeats，成簇规律间隔短回文重复序列)技术进行检测，在crispr cas系统中，cas蛋白在crrna(crispr-derivedrna)的引导下，识别目标序列后启动“附带切割”活性。在体系中加入荧光报告分子，借用cas酶附带切割活性，实现待检序列信息向荧光信号的转化。通过raa与cas蛋白的偶联，能够实现“序列扩增”(raa完成)加上“酶促级联”(cas酶完成)的两级放大，从而超越q-pcr这种单级扩增的灵敏度。此外，因为raa扩增方式无需复杂的温度改变，从而摆脱了对q-pcr仪等精密仪器的依赖，使得crispr-cas技术在鼻疽伯克霍尔德氏菌的现场诊断方面具有广阔的应用前景。

56、实验证明，本发明所提供的crispr检测引物和crrna以及相应的检测方法具有检测时间短、扩增效率高、灵敏度好且特异性强等特点，对鼻疽伯克霍尔德氏菌基因组的检测灵敏度可达10拷贝/反应，搭配荧光手电筒可实现实验样品可视化荧光检测。本发明具有成本低，操作便捷、耗时少、灵敏度高、特异性强、简单便捷等特点，全程在37～40℃环境下进行，可以有效脱离实验室大型仪器的依赖,在鼻疽伯克霍尔德氏菌的现场诊断方面具有广阔的应用前景。