一种基于Fiber1基因的禽安卡拉病毒荧光定量检测方法

本发明属于动物医学检测，具体涉及一种基于fiber1基因的禽安卡拉病毒荧光定量检测方法。

背景技术：

1、禽安卡拉病，又称心包积液综合征或心包积水-肝炎综合征，是由i 群禽腺病毒（fowl aviadenovirus，fadv）血清4型强毒感染引起的以心包积有淡黄色透明或胶冻状渗出液为典型病变并伴有一定程度肝炎病变的急性传染病。

2、3～10周龄的幼年鸡、鸭、鹅最为易感，死亡率可达10%～80%。在种禽和产蛋禽群中，可引起产蛋下降10%～30%。然而，目前对于禽安卡拉病毒的感染尚无有效的治疗方法，因此，建立能够进行快速、准确检测禽安卡拉病毒的方法，对于防控净化禽安卡拉病具有重要的意义。

3、禽安卡拉病可通过微生物学和病毒分离的方法进行诊断，但存在检测周期长，步骤复杂，人员要求高的问题。血清学检测方法和pcr检测方法是当前比较普遍的病毒检测方法，其中血清学检测方法相对简单，但交叉反应是血清学检测方法应用过程中比较常见的问题。相较于血清学的诊断方法，pcr检测方法具有灵敏性强，特异性高的特点，因而，更适用于禽安卡拉病毒的检测。在pcr检测方法中，普通pcr开放检测可能会造成环境污染，进而导致假阳性。而荧光定量pcr诊断方法可弥补该缺点，且其操作简单，检测的敏感度和特异性更高，因而，建立一种禽安卡拉病毒的荧光定量pcr检测方法，最为适用于临床禽安卡拉病的诊断。

4、王国康等建立了一种基于禽安卡拉病毒六邻体基因的荧光定量pcr检测方法，该方法用fadv-4 hb1510株的鸡胚半数感染量（eid50）作为标准品进行敏感性分析，因而不能实现绝对定量反映方法敏感性和检测样品感染强度的效果[1]。

5、此外，其他基于六邻体基因的荧光定量pcr检测方法，虽然都对方法的敏感度进行了定量分析，但其敏感度范围为2.03拷贝/μl-7.1×102拷贝/μl不等，无法实现更低的浓度检测[2-7]。

6、张云丹建立的方法敏感度为2.03拷贝/μl，但其在临床应用性评价试验中，选用的样品为禽安卡拉病毒感染的疑似病例（仅体现临床症状，非确诊病例），且检出率只有80%，因而不能实现精确反应方法检出率的效果[2]。

7、fadv-4 的纤突蛋白1(fiber 1)位于病毒粒子表面，具有特异性的抗原决定簇。且研究表明腺病毒的fiber蛋白会在病毒感染宿主的早期得到大量表达，是临床诊断的重要靶标。

8、基于上述问题，亟待建立了一种基于禽安卡拉病毒fiber 1基因的高灵敏性、高特异性和高准确性的实时荧光定量pcr检测方法，可为预防、净化禽安卡拉病奠定重要基础，同时也可为临床禽安卡拉病的流行病学调查提供保障。

9、参考文献：[1] 王国康,卢琴,贾妙妙等.禽腺病毒4型荧光定量pcr检测方法的建立与初步评估[j].中国兽医杂志,2022,58(02):22-26.

10、[2] 张云丹,杨源,王军等.ⅰ群禽腺病毒血清4型taqman探针实时荧光定量pcr检测方法的建立及应用[j].西北农业学报,2019,28(06):868-876.

11、[3] 吴双,张聪,袁慧莎等.血清4型禽腺病毒taqman探针实时荧光定量pcr检测方法的建立与应用[j].江苏农业学报,2023,39(01):134-141.

12、[4] 卢清侠,金前跃,冯丽丽等.禽腺病毒血清4型sybr greenⅰ荧光定量pcr检测方法的建立与应用[j].河南农业科学,2022,51(12):131-138.

13、[5] 招丽婵,王占新,罗洋洋等.血清4型禽腺病毒taqman荧光定量pcr方法的建立及初步应用[j].广东畜牧兽医科技,2020,45(05):48-52.

14、[6] 刘琳,何春辉,王赛楠等.血清4型禽腺病毒taqman实时荧光定量pcr检测方法的建立[j].中国兽医学报,2020,40(05):928-932.

15、[7] 罗洋洋,李群辉,林丽苗等.禽腺病毒血清4型taqman荧光定量pcr检测方法的建立与应用[j].中国兽医杂志,2020,56(04):39-42+47+143.

技术实现思路

1、基于fiber1基因设计的f1f1/f1r1引物序列及fip探针序列，具有很高的特异性，仅能对禽安卡拉病毒进行特异性的扩增，而对禽类常感染的细菌：大肠杆菌、沙门氏菌；dna病毒：禽白血病病毒；和寄生虫：组织滴虫、毒害艾美尔球虫均无特异性扩增；本发明所建立的禽安卡拉病毒荧光定量pcr检测方法敏感度高，对质粒标准品的最低检测限度为1.9拷贝/μl；通过本方法对含有禽安卡拉病毒的商品化样品进行检测，检出率为100%。

2、本技术提供一种基于fiber1基因设计的引物，包括引物1；

3、所述引物1的上游序列编号为seq id no:7，下游序列编号为seq id no:8。

4、在一些优选的实施方案中，所述引物1的探针为f1r；序列编号为seq id no:25。

5、本技术还提供一种基于fiber1基因设计的引物探针，包括探针f1r；序列编号为seq id no:25。

6、另外，本技术也提供一种禽安卡拉病毒检测方法，利用所述一种基于fiber1基因设计的引物和探针，包括如下步骤：

7、1）配制待测溶液；

8、2）标准品的制备：利用禽安卡拉病毒fiber1基因所设计的上下游引物间的核酸序列，通过化学合成法连接至puc-18t载体作为质粒标准品；

9、3）标准溶液的配制：稀释合成的质粒标准品，并配置成梯度浓度的系列标准溶液；

10、4）qpcr检测：将引物和探针加入到系列标准溶液样品以及待测样品的基因组dna中，进行qpcr检测；

11、5）利用系列标准溶液得到的系列质粒标准品样品，得到ct值-浓度标准曲线；利用待测样品的ct值，定量检测待测溶液中的fiber1基因的浓度。

12、4. 根据权利要求3所述的检测方法，其中，所述步骤4）中qpcr检测方法为：

13、i）配制qpcr反应体系的溶液；

14、ii）将溶液进行预变性和循环反应。

15、在一些优选的实施方案中，所述步骤i）qpcr反应体系溶液中的引物浓度为0.1μm~0.4μm，优选为0.2 μm。

16、在一些优选的实施方案中，所述步骤i）qpcr反应体系溶液中的探针浓度为0.05μm~0.15μm，优选为0.1 μm。

17、在一些优选的实施方案中，所述引物1反应体系的退火温度为58~60℃，优选为60℃。

18、在一些优选的实施方案中，所述退火时间为20~40s，优选为30 s。

19、在一些优选的实施方案中，所述循环反应的循环次数为40~50次，优选为45次。

20、在一些优选的实施方案中，所述预变性条件为93~97℃，25~35s；循环次数为1次；优选为95℃ 30 s；循环次数为1次。

21、在一些优选的实施方案中，所述循环反应的过程为93~97℃ 8~12s, 58~62℃ 25~35s；循环次数为40~50次；优选为95℃ 10s, 60℃ 30s；循环次数为45次。

22、有益效果：本技术提供了一种禽安卡拉病毒特异性的实时荧光定量pcr诊断方法，所述方法快速、有效（有效性能高达到100%），通过该方法对禽群泄殖腔样品进行定期的禽安卡拉病毒检测与监测，有助于及时制定有效的防控、净化措施，阻断禽安卡拉病的大面积爆发，可为禽安卡拉病的防控和净化奠定基础。

23、1、在禽安卡拉病毒fiber基因序列中找到保守且特异性好的片段；

24、2、发明禽安卡拉病毒实时荧光定量pcr诊断方法的最佳反应条件。

25、3、所述方法的敏感性良好，能实现更低基因拷贝数的准确检测：检出的最低基因拷贝数为1.9拷贝/μl；

26、4、所述方法检出率高：对目前商品化的含有禽安卡拉病毒的生物样品，均能检出，检出率高达100%。