一种蔗糖酶-C反应蛋白抗体及其制备方法

本发明属于生物制剂，特别是涉及一种蔗糖酶-c反应蛋白抗体及其制备方法。

背景技术：

1、2011年美国伊利诺斯大学陆艺教授发表了基于蔗糖酶-核酸偶联物的血糖仪检测系统能够用于非葡萄糖靶标检测的文章，这一研究成果开辟了基于血糖仪检测各类靶标的先河。大量的研究者们开始投入利用血糖仪检测各类非糖靶标的研究，以期为实现人类疾病的居家自测提供新的可能。抗体是一种能够特异性识别相应抗原的特异性蛋白分子。研究者们基于抗体的特异性识别作用，设计将抗体偶联到蔗糖酶上，形成蔗糖酶-抗体偶联物，从而基于血糖仪实现各种抗原的检测，该方法对于进一步实现疾病居家自测具有十分重要的意义。这一方法中，蔗糖酶标记抗体的好坏直接关系到基于血糖仪检测技术的成功与否，因此被称为该技术中最关键的酶试剂。

2、目前，制备蔗糖酶-抗体复合物的方法包括：基因工程法、戊二醛交联法、生物偶联法及生物矿化法，各方法的优劣势如下：

3、基因工程法：基因工程是指在体外的人工环境条件下，通过将人为设计或拼接的基因重新导入到其他生物中进行表达，产生出所需要的新基因产物的过程。基因工程法制备出的产物纯度高、稳定性好，且适合大规模制备。然而，基因工程前期设计重组基因过程复杂，错误率高，导致基因产物生产成本高。

4、戊二醛交联法：戊二醛是一种常见的蛋白质交联剂，通过其醛基分别与酶和抗体的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-抗体结合物。戊二醛交联法的特点是反应快、结合量高。但是，戊二醛交联形成自组装体的球状蔗糖酶-抗体复合物，由于空间位阻效应会导致酶活性下降。此外，戊二醛交联法需要对酶结合物进行纯化，操作过程复杂繁琐，而且纯化的过程容易造成酶结合物流失，增大成本。上述这些都限制了该方法在酶标记物制备方面的商用化应用。

5、生物偶联法：生物偶联法指从生物体内分离出来特异性识别抗体c端的物质，如分选酶a、蝶豆粘酶、细菌卤烷脱卤酶等，随后与含有n端甘氨酸残基的亲核底物形成新的肽键。该方法非常适合于实现抗体载体的位点特异性标记。但是，该方法的缺点是生产条件相对来说步骤冗长且苛刻，并且偶联效率很低。

6、生物矿化法：生物矿化法通过将酶、氨基酸等有机成分与无机盐(硝酸盐等)用共沉淀的方法连接在一起，从而制备出具有复杂形状的多孔纳米颗粒，随后在颗粒表面通过静电作用吸附抗体，形成抗体修饰的颗粒材料。该方法直接简单快速、酶包封率高。但是，该方法通过将酶包裹在颗粒内部，一定程度影响底物靠近酶活中心，从而严重影响酶活性。此外，该方法制备的抗体功能化颗粒均一度差、稳定性差，较难在实际应用中使用。

7、综上所述，开发一种合成简单、成本低、均一性好、偶联效率高、活性稳定的蔗糖酶-c反应蛋白抗体试剂制备方法，不仅可以为基于血糖仪实现非糖靶标稳固检测奠定基础，而且对于未来家庭环境下实现疾病自我监测具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种效果更好的制备方法，得到蔗糖酶-c反应蛋白抗体

2、本发明采用的技术方案是这样的：蔗糖酶-c反应蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤：

3、c-反应蛋白信号抗体与2-亚氨基硫烷盐酸盐traut’s reagent的反应：首先用缓冲液1将抗体稀释成2mg/ml，然后在每毫升抗体溶液中加入46μl的traut’s reagent，反应60min后，用缓冲液2低温透析至过夜；所述的缓冲液1为50mm三乙胺，ph＝8.0，含有1mm氯化镁、50mm氯化钾、4mm乙二胺四乙酸；所述的缓冲液2为0.1m磷酸一氢钠·磷酸二氢钠，ph＝7.2～7.4，含有0.15m氯化钠，4mm乙二胺四乙酸；

4、4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯smcc与蔗糖酶的反应：首先将smcc溶于1.5mg/ml n-n二甲基甲酰胺中，用缓冲液2将蔗糖酶稀释成1mg/ml，然后在每毫升蔗糖酶溶液中加入100μl的smcc，室温下搅拌30min后，用缓冲液2低温透析至过夜；

5、化学交联：取1mg的crp 2g3抗体于2mg的蔗糖酶溶液中，室温下搅拌30min后，加入50～70μl的n-乙基顺丁烯二酰亚胺nem，室温下搅拌30min后，再加入50～70μl的乙醇胺，室温下搅拌30min后，用缓冲液2低温透析过夜得到蔗糖酶-c反应蛋白抗体。

6、本发明的另一技术方案是通过上述方法得到的蔗糖酶-c反应蛋白抗体。

7、本发明通过2-亚氨基硫烷盐酸盐(traut’s reagent，特劳特试剂)将抗体表面的氨基进行巯基化，然后采用4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)作为双交联剂，smcc一端的马来酰亚胺基团与巯基化的抗体形成稳定的硫醚键，而另外一端的n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs酯)与蔗糖酶上的伯胺基团共价形成酰胺键，最终形成蔗糖酶-c反应蛋白抗体偶联物。偶联抗体与蔗糖酶能够很好的维持蔗糖酶活性，且具有优异的识别抗原能力，因此具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.蔗糖酶-c反应蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法制得的蔗糖酶-c反应蛋白抗体。

技术总结
本发明公开了蔗糖酶‑C反应蛋白抗体及其制备方法，首先通过2‑亚氨基硫烷盐酸盐将抗体表面的氨基进行巯基化，然后采用4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑羧酸琥珀酰亚胺酯作为双交联剂，其一端的马来酰亚胺基团与巯基化的抗体形成稳定的硫醚键，而另外一端的N‑羟基琥珀酰亚胺酯与蔗糖酶上的伯胺基团共价形成酰胺键，最终形成蔗糖酶‑C反应蛋白抗体偶联物。本发明的偶联抗体与蔗糖酶能够很好的维持蔗糖酶活性，且具有优异的识别抗原能力，因此具有广阔的应用前景。

技术研发人员：袁荃,彭天欢,黄种南,王文杰,庞怡民
受保护的技术使用者：湖南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/21