m6A甲基转移酶及相关识别因子基因的siRNA及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及m6a甲基转移酶及相关识别因子基因的sirna及其在疾病治疗方面的应用。

背景技术：

1、m6a(6-甲基腺嘌呤，n6-methyladenosine)甲基化，即在rna腺苷酸(a)第六位的n上发生甲基化修饰，是真核生物rna中最常见的一种转录后修饰，约占rna甲基化修饰的80％左右。

2、m6a rna甲基化是一个动态可逆的修饰过程，该过程需要在m6a甲基转移酶复合物(编码器，writers)、m6a去甲基化酶(消码器，erasers)和m6a读取蛋白(读码器，readers)的参与下催化形成。

3、m6a甲基化修饰主要在mrna前体的剪接、3’端加工、核输出、翻译调节、mrna衰变、mrna的稳定性、环状rna翻译和mirna加工等多个过程中发挥作用，其动态可逆的变化控制对细胞的生长和分化具有重要的调节作用，使得m6a及修饰蛋白的异常在多种重大疾病的发生过程中扮演重要角色。

4、mettl16是第二个鉴定的m6a甲基转移酶。与mettl3-mettl14复合物相比，mettl16特异的修饰u6 snrna(small nuclear rna)和编码s-腺苷甲硫氨酸合成酶的人类mat2amrna。最新研究表明，mettl16更倾向于介导nascent rna的甲基化修饰，这说明mettl16催化m6a修饰具有时(新生rna)空(细胞核)特异性。

5、eif3作为真核翻译起始因子，可以识别并直接结合mrna 5’-utr的m6a位点，以不依赖帽的方式募集43s复合体启动翻译。

6、mettl16可以通过其甲基转移酶结构域与翻译起始因子eif3a/b发生相互作用。mettl16通过与eif3a/b和18s rrna的直接结合促进了43s起始前复合物的形成，随后mettl16通过与60s大亚基的28s和5.8s rrnas直接结合进一步促进了80s核糖体的组装从而增强mrna的翻译效率。

7、研究发现，在所有mettl蛋白家族中，mettl16对肿瘤细胞的生存具有最重要的影响。在几乎所有的肿瘤细胞中，mettl16发挥着比mettl3和mettl14更为关键的促癌基因的功能。

8、sirna(小干扰rna)是一段与靶基因序列同源的、长度在20-25nt的双链rna，可以特异性地引起具有相同序列的mrna的降解，从而阻断相应基因的表达，进而治疗该基因引起的各类疾病。

9、通过提供针对mettl16及eif3a/b沉默的有效sirna，有望在mettl16-eif3a/b复合物调控相关肿瘤治疗领域提供新型sirna药物。

10、现有的技术中，目前并没有针对m6a甲基转移酶及m6a识别因子的靶向治疗药物。本发明针对m6a甲基转移酶及相关识别因子基因设计sirna并有效干扰基因表达，有望突破m6a甲基转移酶及相关识别因子基因引起的疾病治疗方面的瓶颈。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供m6a甲基转移酶及相关识别因子基因的sirna及其在疾病治疗方面的应用，其针对m6a甲基转移酶及相关识别因子设计特异性sirna作为靶向治疗药物，sirna寡聚核酸组合可以有效抑制包含mettl16、eif3a、eif3b在内的及m6a识别蛋白的表达，抑制其生物学功能的发挥。

2、本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：

3、m6a甲基转移酶及相关识别因子基因的sirna，包含mettl16、eif3a、eif3b在内的甲基转移酶及m6a识别蛋白的sirna寡聚核酸组合。

4、作为本发明的进一步的技术方案：所述sirna为一种核酸分子，包括gp-mettl16-10、gp-eif3a-1、gp-eif3a-3、gp-eif3a-10、gp-eif3b-7。

5、作为本发明的进一步的技术方案：所述核酸分子为双链rna分子。

6、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-mettl16-10由如下序列的正义链和反义链组成：

7、正义链：5’-gauugaguuauuuggacgatt-3’，

8、反义链：5’-ucguccaaauaacucaauctt-3’。

9、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-eif3a-1由如下序列的正义链和反义链组成：

10、正义链：5’-caguggaucuguugugauatt-3’，

11、反义链：5’-uaucacaacagauccacugtt-3’。

12、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-eif3a-3由如下序列的正义链和反义链组成：

13、正义链：5’-guuuagcugacagauuugatt-3’，

14、反义链：5’-ucaaaucugucagcuaaactt-3’。

15、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-eif3a-10由如下序列的正义链和反义链组成：

16、正义链：5’-ggacuucauucaugcuaautt-3’，

17、反义链：5’-auuagcaugaaugaagucctt-3’。

18、作为本发明的进一步的技术方案：所述gp-eif3b-7由如下序列的正义链和反义链组成：

19、正义链：5’-agauaaggaaugagugauatt-3’，

20、反义链：5’-uaucacucauuccuuaucutt-3’。

21、如上述的m6a甲基转移酶及相关识别因子基因的sirna在疾病治疗方面的应用。

22、如上述的m6a甲基转移酶及相关识别因子基因的sirna的检测试剂盒，包含mettl16、eif3a、eif3b的引物。

23、作为本发明的进一步的技术方案：所述mettl16由如下序列的上游引物和下游引物组成：

24、上游引物：5’-tgagatgggccttagcttgg-3’，

25、下游引物：5’-cgcagaggtgatgctttgag-3’。

26、作为本发明的进一步的技术方案：所述eif3a由如下序列的上游引物和下游引物组成：

27、上游引物：5’-caaacgcgccaacgaatttct-3’，

28、下游引物：5’-cgaagatccacgcaaagttcc-3’。

29、作为本发明的进一步的技术方案：所述eif3b由如下序列的上游引物和下游引物组成：

30、上游引物：5’-ctcagcccattggcctattt-3’，

31、下游引物：5’-cacccagaaggcgattatgtt-3’。

32、如上述的m6a甲基转移酶及相关识别因子基因的sirna在检测试剂盒方面的应用。

33、综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

34、本发明公开了一种m6a甲基转移酶及相关识别因子基因的sirna及其在疾病治疗方面的应用，其针对m6a甲基转移酶及相关识别因子设计特异性sirna作为靶向治疗药物，sirna寡聚核酸组合可以有效抑制包含mettl16、eif3a、eif3b在内的及m6a识别蛋白的表达，抑制其生物学功能的发挥。