一种将神经干细胞球诱导成神经元的方法与流程

本发明涉及一种将神经干细胞球诱导成神经元的方法，属于细胞生物学。

背景技术：

1、神经干细胞是指存在于神经系统中，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。神经元即神经元细胞，是神经系统最基本的结构和功能单位，分为细胞体和突起两部分。一个典型的神经元能够通过树突和胞体一次接收上千条信息。当胞体被充分唤起时，它自己的信息便会被传递给轴突，轴突通过动作电位将信息传递到突触小体。这个含有神经递质的小泡破裂，将神经递质释放到突触间隙中。形状合适的神经递质分子来到突触后膜时，会停留在受体上并刺激接收细胞。多余的神经递质通过再摄取过程被回收到“发送”神经元中。现有技术中有大量文献报导，神经干细胞移植在治疗脑梗死、缺血性脑卒中、帕金森等多种神经系统的疾病发挥了较好的效果。在近期nature中，一步产生神经元，为治愈帕金森病带来希望，在新型治疗药物的研发上具有广阔的前景。

2、关于诱导神经元的方法，中国发明专利申请cn 103667190 a公开了一种诱导形成神经元的方法和组合物，其首先将neurod1基因构建在病毒载体上，包装获得带有neurod1的假病毒颗粒，并通过neurod1假病毒颗粒感染胶质细胞后，经过一段时间的培养，即可将胶质细胞分化为神经元细胞。其通过转染技术获得神经元。中国发明专利申请cn109385404 a公开了一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用，利用目的基因mrna转染干细胞后，诱导干细胞分化，得到神经元，称为mrna诱导神经元。该方法利用了人诱导性多能干细胞ipscs的生物学特性，通过脂质体转染mrna表达促神经元分化的转录因子，从而实现干细胞体外定向分化为神经元。其同样通过转染技术获得神经元。中国发明专利申请cn 105331583a公开了一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，该方法包括以下步骤：将ips细胞消化后吹吸分散成单个细胞悬液，分种在培养孔中，每孔加入rock抑制剂；分种后的第一天，吸弃上清液，加入神经诱导完全培养基，培养直至获得p1代的神经干细胞；将p1代的神经干细胞接种到神经元诱导培养基中培养，培养基中要添加雷帕霉素以促进自噬的发生；2天后，将培养基更换为添加低浓度的雷帕霉素以促进自噬的神经元细胞分化培养基，培养至12-15天可诱导分化为神经元细胞。其需先诱导出神经干细胞，再诱导成神经元，操作复杂，诱导时间长，诱导神经元的纯度有待考究。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明提供了一种高效诱导神经元的方法——将神经干细胞球诱导成神经元的方法。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种将神经干细胞球诱导成神经元的方法：取神经干细胞球的单细胞悬液，用神经元培养基重悬，接种至预先包被处理的细胞培养板，于37℃、5％ co2条件下诱导培养10天，即得神经元。

4、进一步地，所述神经干细胞球的单细胞悬液是通过以下方法得到的：收集人源悬浮培养的细胞球，离心，弃掉上清，加入适量accutase酶(现有技术中已有的商品化试剂)，37℃恒温震荡孵育10～30min，用移液枪吹打成单细胞悬液。所述人源悬浮培养的细胞球，通过常规技术手段即可得到。更进一步地，离心条件为：50g离心5min；移液枪吹打的次数为20～30下。

5、进一步地，所述包被处理的具体方式为：向细胞培养板中加入laminin(层粘连蛋白溶液，现有技术中已有的商品化试剂)，于37℃、5％ co2条件下孵育8～14小时。

6、更进一步地，所述细胞培养板为24孔细胞培养板。

7、更进一步地，所述laminin的工作浓度为10ng/ml，每孔加入300μl的laminin。

8、进一步地，细胞培养板的接种密度为：1×104～1×105/孔，优选4×104/孔。

9、进一步地，细胞培养板中每孔加入的神经元培养基的体积为500μl。

10、进一步地，诱导培养的第4天和第7天，进行半量换液。所述半量换液是指吸出250μl神经元培养基，加入350μl的新鲜神经元培养基。

11、本发明的将神经干细胞球诱导成神经元的方法，由人神经干细胞球直接诱导神经元，不用通过转染技术获取神经元，也不用其他细胞诱导成神经干细胞，再诱导成神经元。本发明的方法的诱导时间短，诱导效率高，解决了诱导时间长、神经元诱导效率低的问题。

技术特征：

1.一种将神经干细胞球诱导成神经元的方法，其特征在于：取神经干细胞球的单细胞悬液，用神经元培养基重悬，接种至预先包被处理的细胞培养板，于37℃、5％co2条件下诱导培养10天，即得神经元。

2.根据权利要求1所述的将神经干细胞球诱导成神经元的方法，其特征在于，所述神经干细胞球的单细胞悬液是通过以下方法得到的：收集人源悬浮培养的细胞球，离心，弃掉上清，加入accutase酶，37℃恒温震荡孵育10～30min，用移液枪吹打成单细胞悬液。

3.根据权利要求2所述的将神经干细胞球诱导成神经元的方法，其特征在于：所述离心的条件为：50g离心5min；移液枪吹打的次数为20～30下。

4.根据权利要求1所述的将神经干细胞球诱导成神经元的方法，其特征在于，所述包被处理的具体方式为：向细胞培养板中加入laminin，于37℃、5％co2条件下孵育8～14小时。

5.根据权利要求1或4所述的将神经干细胞球诱导成神经元的方法，其特征在于：所述细胞培养板为24孔细胞培养板。

6.根据权利要求4所述的将神经干细胞球诱导成神经元的方法，其特征在于：所述laminin的工作浓度为10ng/ml，每孔加入300μl的laminin。

7.根据权利要求1所述的将神经干细胞球诱导成神经元的方法，其特征在于：所述细胞培养板的接种密度为1×104～1×105/孔。

8.根据权利要求7所述的将神经干细胞球诱导成神经元的方法，其特征在于：所述细胞培养板的接种密度为4×104/孔。

9.根据权利要求1所述的将神经干细胞球诱导成神经元的方法，其特征在于：所述细胞培养板中每孔加入的神经元培养基的体积为500μl。

10.根据权利要求1所述的将神经干细胞球诱导成神经元的方法，其特征在于：所述诱导培养的第4天和第7天，进行半量换液。

技术总结
本发明公开了一种将神经干细胞球诱导成神经元的方法：取神经干细胞球的单细胞悬液，用神经元培养基重悬，接种至预先包被处理的细胞培养板，于37℃、5％CO<subgt;2</subgt;条件下诱导培养10天，即得神经元。所述神经干细胞球的单细胞悬液是通过以下方法得到的：收集人源悬浮培养的细胞球，离心，弃掉上清，加入Accutase酶，37℃恒温震荡孵育10～30min，用移液枪吹打成单细胞悬液。本发明的方法由人神经干细胞球直接诱导神经元，不用通过转染技术获取神经元，也不用其他细胞诱导成神经干细胞，再诱导成神经元。本发明的方法的诱导时间短，诱导效率高，解决了诱导时间长、神经元诱导效率低的问题。

技术研发人员：杨敏,陈小威,朱紫薇,刘浩然,张紫瑞,张换红,郭红玉
受保护的技术使用者：北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12