一种小鼠结直肠组织单细胞悬液解离试剂盒及其应用

本发明属于单细胞，具体涉及一种小鼠结直肠组织单细胞悬液解离试剂盒及其应用。

背景技术：

1、结直肠是大肠的重要组成部分。结肠细分为升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠，主要帮助人体吸收水分和无机盐，并为消化吸收后的食物残渣提供暂时储存场所，将食物转化为粪便。此外，结肠内腺体细胞会分泌黏液，形成肠道黏液层，以保护结肠内壁免受消化酶和其他有害物质的刺激。直肠是结肠末端较短的段落，其主要功能是储存粪便。结直肠主要由粘膜层、皮质层、肌肉层、固有层和浆膜层组成，共同帮助促进吸收水分和无机盐并生成和储存粪便。

2、在单细胞研究中，单细胞悬液的制备对后续实验是否顺利开展以及下游数据的质量至关重要。现有的小鼠结直肠单细胞悬液制备方案中常存在细胞活率低、结团率高、细胞碎片多、背景杂质多等问题，影响后续实验，最终影响数据质量。故基于此，提出本发明方案。

技术实现思路

1、针对目前所存在的技术问题，本发明提供了一种小鼠结直肠组织单细胞悬液解离试剂盒及其应用，使用本发明的技术方案中的试剂盒分离小鼠结直肠，能够获得高活率且背杂质低的单细胞悬液。

2、为了达到上述目的，本发明采用了如下技术手段：

3、本发明的第一方面提供了一种小鼠结直肠单细胞悬液的解离试剂盒，由如下组分组成：第一酶解液、第二酶解液、第三酶解液、pbs缓冲液、rpmi-1640培养基以及红细胞裂解液；

4、所述第一酶解液为浓度20mm的edta-pbs溶液；

5、所述第二酶解液为浓度0.25％的胰蛋白酶-edta溶液；

6、所述第三酶解液由中性蛋白酶和胶原酶i、胶原酶ii溶于培养基中配制而成，其中中性蛋白酶浓度为100mg/ml，胶原酶i浓度为100mg/ml、胶原酶ii浓度为100mg/ml。

7、在本发明的一些实施方案中，所述第一酶解液、第二酶解液、第三酶解液的保存温度为-20℃。

8、在本发明的一些实施方案中，所述第一酶解液使用时采用pbs稀释至工作浓度，第二酶解液、第三酶解液使用时采用rpmi-1640培养基溶液稀释至工作浓度。

9、本发明的第二方面提供了一种用第一方面所述的解离试剂盒制备小鼠结直肠单细胞悬液的方法，包括如下步骤：

10、s1.试剂准备：将冷藏的第一酶解液、第二酶解液、第三酶解液置于冰上解冻，第一酶解液采用pbs稀释至工作浓度；第二酶解液、第三酶解液采用rpmi-1640培养基稀释至工作浓度；

11、s2.样本准备：取无血渍和杂质的小鼠结直肠于样本管a中，在冰上处理成碎块后用pbs溶液反复清洗至干净；

12、s3.第一次消化：向样本管a中加入2-4ml第一解离液，恒温水浴震荡消化，取出后吸取样本管a中所有溶液过细胞筛，筛网上的剩余组织装入样本管b中备用，过筛滤液装入样本管c中离心后弃上清，用pbs重悬细胞沉淀，再次离心后弃上清，再用rpmi-1640培养基重悬细胞沉淀，得到细胞悬液a；

13、s4.第二次消化：向s3中样本管c中加入2-4ml第二解离液，恒温水浴震荡消化；取出后将样本管c中所有溶液过细胞筛，过筛滤液离心后弃上清，用rpmi-1640培养基重悬细胞沉淀，得到细胞悬液b；

14、s5.第三次消化：向s3中样本管b中加入2-4ml第三解离液，恒温水浴震荡消化；取出后吸取样本管b中所有溶液过细胞筛，过筛滤液离心后弃上清，用rpmi-1640培养基重悬细胞沉淀，得到细胞悬液c；

15、s6.红细胞裂解：将细胞悬液b，细胞悬液c合并到样本管d中，加入5-10ml红细胞裂解液，常温裂解后离心弃上清；

16、s7.单细胞悬液：向样本管d中加入pbs溶液吹打混匀，离心后弃上清，用rpmi-1640培养基重悬细胞沉淀，即得到单细胞悬液。

17、在本发明的一些实施方案中，所述第一次消化步骤中，第一解离液的工作浓度为10-20mm。

18、消化方法为：置于水浴恒温震荡仪中，37℃，120rpm条件下震荡消化8-12min；一些优选实施方案中，第一解离液的工作浓度为20mm，消化10min。

19、在本发明的一些实施方案中，所述第二次消化步骤中，第二解离液的工作浓度为0.1％-0.25％。

20、消化方法为：置于水浴恒温震荡仪中，37℃，120rpm条件下震荡消化1-3min；一些优选实施方案中，第二解离液的工作浓度为0.25％，消化2min。

21、在本发明的一些实施方案中，所述第三次消化步骤中，第三解离液的工作浓度为胶原酶i 0.5-2mg/ml、胶原酶ii 0.5-2mg/ml、中性蛋白酶0.5-2mg/ml，采用rpmi-1640溶液稀释。

22、消化方法为：置于水浴恒温震荡仪中，37℃，120rpm条件下震荡消化8-12min；一些优选实施方案中，第三解离液的工作浓度为胶原酶i1mg/ml、胶原酶ii 1mg/ml、中性蛋白酶1mg/ml；消化10min。

23、在本发明的一些实施方案中，步骤s3、步骤s4、步骤s5、步骤s7中，离心条件为400g，4℃离心；步骤s6中，离心条件为300g，4℃离心；步骤s3、步骤s4、步骤s5中，细胞筛为30μm细胞筛。

24、本发明的第三方面提供了第二方面所述的方法制备得到的小鼠结直肠单细胞悬液。

25、本发明的第四方面提供了第三方面所述的小鼠结直肠单细胞悬液在单细胞检测中的应用。如应有在单细胞测序，单细胞分选检测等方面。

26、本发明的有益效果

27、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种小鼠结直肠单细胞悬液解离试剂盒，该试剂盒中的解离液所用试剂材料易获取，无有害成分，安全环保。采用该试剂盒制备小鼠结直肠单细胞悬液的方法，该方法操作简单，采用多步消化法，各操作步骤相互影响，配合后的最终结果有很高的成功率，得到的细胞浓度在1×106个/ml以上，并且细胞活率达91％以上，采用该方法能够稳定地得到高活率且杂质低的小鼠结直肠单细胞悬液，能有效地应用在单细胞测序及其他单细胞检测方面，能够满足10x genomics平台上机细胞悬液活率达90％以上的标准。

技术特征：

1.一种小鼠结直肠单细胞悬液的解离试剂盒，其特征在于：由如下组分组成：第一酶解液、第二酶解液、第三酶解液、pbs缓冲液、rpmi-1640培养基以及红细胞裂解液；

2.根据权利要求1所述的一种小鼠结直肠单细胞悬液的解离试剂盒，其特征在于：所述第一酶解液、第二酶解液、第三酶解液的保存温度为-20℃。

3.根据权利要求1所述的一种小鼠结直肠单细胞悬液的解离试剂盒，其特征在于：所述第一酶解液使用时采用pbs稀释至工作浓度；第二酶解液、第三酶解液使用时采用rpmi-1640培养基稀释至工作浓度。

4.一种用权利要求1-3任一项所述的解离试剂盒制备小鼠结直肠单细胞悬液的方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备小鼠结直肠单细胞悬液的方法，其特征在于，所述第一次消化步骤中，第一解离液的工作浓度为10-20mm的edta溶液，消化方法为：置于水浴恒温震荡仪中，37℃，120rpm条件下震荡消化8-12min。

6.根据权利要求4所述的制备小鼠结直肠单细胞悬液的方法，其特征在于，所述第二次消化步骤中，第二解离液的工作浓度为0.1-0.25％胰蛋白酶-edta溶液，消化方法为：置于水浴恒温震荡仪中，37℃，120rpm条件下震荡消化1-3min。

7.根据权利要求4所述的制备小鼠结直肠单细胞悬液的方法，其特征在于，所述第三次消化步骤中，第三解离液的工作浓度为胶原酶i 0.5-2mg/ml、胶原酶ii 0.5-2mg/ml、中性蛋白酶0.5-2mg/ml，消化方法为：置于水浴恒温震荡仪中，37℃，120rpm条件下震荡消化8-12min。

8.根据权利要求4所述的制备小鼠结直肠单细胞悬液的方法，其特征在于，步骤s3、步骤s4、步骤s5、步骤s7中，离心条件为400g，4℃离心；步骤s6中，离心条件为300g，4℃离心；步骤s3、步骤s4、步骤s5中，细胞筛为30μm细胞筛。

9.权利要求4-8任一项所述的方法制备得到的小鼠结直肠单细胞悬液。

10.权利要求9所述的小鼠结直肠单细胞悬液在单细胞检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种小鼠结直肠单细胞悬液的解离试剂盒，由如下组分组成：第一酶解液、第二酶解液、第三酶解液、PBS缓冲液、RPMI‑1640培养基以及红细胞裂解液；第一酶解液为浓度20mM的EDTA溶液；第二酶解液为浓度0.25％的胰蛋白酶‑EDTA溶液；第三酶解液中中性蛋白酶浓度为100mg/mL、胶原酶I浓度为100mg/mL、胶原酶II浓度为100mg/mL；还公开了采用该解离试剂盒提取小鼠结直肠单细胞悬液的方法。该试剂盒中的解离液所用试剂材料易获取，无有害成分，安全环保，方法操作简单，各步骤配合后的最终结果有很高的重复性和成功率，能够稳定地得到高活率且杂质低的小鼠结直肠单细胞悬液。

技术研发人员：荣圣予,郎秋蕾,何炳楠,朱琳达
受保护的技术使用者：杭州师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25