一种非洲猪瘟病毒传代致弱毒株与基于该毒株的疫苗

本发明属于兽医生物制品领域，涉及一种非洲猪瘟病毒传代致弱毒株与基于该毒株的疫苗。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)感染引起的家猪或野猪的一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(world organization for animal health，woah)将asf列为法定报告动物疫病。中国将asf列为一类动物疫病。asf的临床表现包括最急性、急性、亚急性和慢性。急性症状主要为：体温升高，沉郁，厌食，耳、四肢、腹部皮肤有出血点，可视黏膜潮红、发绀，眼、鼻有黏液脓性分泌物，呕吐，便秘、粪便表面有血液和黏液覆盖，腹泻，粪便带血，共济失调或步态僵直，瘫痪，抽搐，呼吸困难，妊娠母猪流产，死亡率可达100％。

2、asfv是非洲猪瘟病毒科(asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(asfivirus)的唯一成员。asfv基因组为双链线性dna，大小为170-194kb，包含150-167个开放阅读框，编码54种结构蛋白和100多种非结构蛋白。根据b646l基因(编码p72蛋白)末端约500bp核苷酸的序列差异，asfv已被划分成24种基因型。

3、据woah的统计，asf已在非洲、欧洲、亚洲和加勒比海地区近50个国家暴发和流行，造成了巨大经济损失，严重危害全球养猪业及相关产业的稳定发展。

4、在中国首次分离鉴定的asf毒株为asfv hlj/18株(genbank:mk333180.1，其中全称pig/hlj/2018)。asfv hlj/18株为强毒株，接种猪死亡率为100％。经全基因组序列测定及进化分析证实，asfv hlj/18株为基因ⅱ型强毒株。随着asfv在中国不断流行与进化，2020年在中国田间分离鉴定出无血细胞吸附活性的中等毒力基因ii型毒株hlj/hrb1/20株(genbank:mw656282.1，其中全称pig/heilongjiang/hrb1/2020)，2021年在中国分离鉴定出低毒力基因i型毒株sd/dy-i/21株(genbank:mz945537.1，其中全称pig/sd/dy-i/2021)，2023年首次报道了基因i型与基因ii型自然重组强毒株js/lg/21株(genbank：oq504956.1，其中全称pig/jiangsu/lg/2021)，这使中国asf防控面临更严峻的挑战。值得关注的是，以基因ii型病毒为亲本构建的弱毒疫苗株hlj/18-7gd株(参见申请号为cn202310363645.0的中国专利申请)，不能对此类基因i型和ii型重组强毒株(比如，js/lg/21株)产生良好免疫保护。此类基因i型和ii型重组强毒株(比如，js/lg/21株)自2021年在中国首次被检出。

5、疫苗免疫一直是传染病防控最经济、最有效的手段。牛瘟、牛肺疫、经典猪瘟和马传染性贫血等动物疫病的控制或消灭均得益于安全有效疫苗免疫。asfv强毒感染耐过猪可抵御同源强毒的再次感染，这提示疫苗免疫预防asf具理论可行性。科学家们进行了大量的疫苗研究。

6、已报道的非洲猪瘟病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、重组载体疫苗等均未取得理想的临床保护效果。

7、自然变异弱毒株(例如，基因ⅰ型的nh/p68和our t88/3毒株，基因型ⅱ型lv17/wb/rie1毒株)接种后能够有效保护同源强毒的攻击，但该接种导致皮肤溃烂、关节炎等慢性病症，仍有一定的残余毒力。

8、基因缺失减毒株(如缺失i177l基因的asfv-g-δi177l毒株、缺失cd2v基因的ba71δcd2v毒株、组合缺失cd2v基因与uk基因的asfv sy18-δcd2v/uk毒株，组合缺失mgf360/505基因和cd2v基因的hlj/18-7gd毒株等)接种猪只后未发现明显的临床症状，且该接种能有效保护同源强毒的攻击。但这些基因缺失减毒株接种猪只后均不能提供针对新出现的基因i型和ii型重组强毒株(js/lg/21株)的异源交叉保护。已经开展了涉及hlj/18-7gd株的临床试验，asfv-g-δi177l减毒疫苗已在越南获得批准应用。有研究发现多个毒力相关基因的组合缺失可能影响asfv的免疫原性，并导致不能抵御同源强毒株的攻击。通过组合缺失9gl基因和uk基因的双基因缺失hlj/18-9gl&uk-del株以及在基因i型和ii型重组强毒株(js/lg/21株)基础上联合缺失mgf360/505基因和cd2v(共7个基因)的js/lg/21-7gd缺失株接种猪后均无临床症状。但该两种基因缺失株接种不能有效抵御同源强毒株的攻击。

9、病原体传代致弱是疫苗研究的重要技术路径。牛瘟、牛肺疫、经典猪瘟和马传染性贫血等疫病的疫苗研发均采用动物或细胞传代的技术路径。传代致弱疫苗在这些疫病防控中发挥了重要作用，实现了中国牛瘟、牛肺疫与马传贫的根除与净化，以及经典猪瘟的有效防控。在1957年asfv传入葡萄牙后开展了asfv细胞适应研究。代表性asfv适应株为l'60bm89株、ba71v株、e75cv1株等。1963年，ribeiro等人将在葡萄牙分离的1455毒株在骨髓细胞上连续传代并发现其毒力逐渐致弱。将传代70代致弱的病毒接种猪，接种猪的猪临床症状大大减轻并能抵御强毒株攻击。hess等人1965年利用pk-2a细胞传代获得多株致弱毒株。1967年greig等人将spencer株传至35代后，f35接种猪无临床症状且能抵御亲本毒株攻击。greig等人将portuguese challenge株传至34代后，f34接种猪出现体温小幅波动且能抵御亲本毒株攻击。greig等人将gasson株传至23代后，接种猪毒力减弱但不能抵御亲本毒株攻击。1976年研究人员将ba71株在vero细胞上适应传代100代，最终获得无致病力的vero细胞适应株(ba71v株)。1979年，thomson等人使用cv细胞传代致弱毒株接种2头猪，接种猪不能有效抵御强毒株攻击。俄罗斯联邦兽医病毒学和微生物学研究所获得了多株细胞传代asfv致弱株。将1949年在刚果获得的分离株在猪肾细胞传至50代后再在猪骨髓细胞传262代。将1964年在法国获得的分离株在猪骨髓细胞上传135代。上述毒株未进行免疫接种及攻毒保护试验。2015年，krug等人将格鲁吉亚毒株(asfv-g株)vero细胞适应株第110代接种猪，接种的猪无任何临床反应，但不能有效抵御强毒株攻击。2015年balysheva等人将stavropol 01/08强毒株分别在猪肾胚胎细胞系与猪淋巴细胞杂交细胞系上(the hybridcell line spev tk with pig lymphocytes，a4c2)传24代、在cv细胞传20代后接毒猪全部存活，但无法提供有效保护。在i177l基因缺失毒株(asfv-g-δi177l株)的基础上继续缺失左侧可变区获得asfv-g-δi177l/δlvr株，该毒株能够在梅岛猪上皮细胞系(plum islandporcine epithelial cells，pipec)稳定高效增殖，接种猪无临床症状且对同源强毒株提供有效保护。2021年，wang等人将中国分离株(asfv-hlj/18株)在hek293t细胞中连续传代至121代获得高效复制毒株，但回归pam细胞复制效率极低，致病力和免疫原性有待进一步研究。

10、1921首次发现asfv，目前已在50多个国家流行，给世界养猪及相关行业造成巨大经济损失。科学家们开展了大量的疫苗研究，尝试了各种疫苗研发策略。已经报道的灭活疫苗、亚单位疫苗、重组载体疫苗保护效果不理想；自然变异弱毒株的接种能够有效保护同源强毒的攻击，但接种猪存在皮肤溃烂、关节炎等慢性病症，仍有一定的残余毒力；有些基因缺失减毒株的接种能有效保护同源强毒的攻击，但不能提供针对异源毒株的交叉保护；有些因基因缺失影响asfv的免疫原性，导致不能抵御同源强毒株的攻击；有些传代致弱毒株能抵御亲本强毒株攻击但存在残余毒力。有些传代致弱毒株完全失去免疫原性因此不能提供保护。到目前为止，仍无安全有效的非洲猪瘟疫苗可供推广临床应用。很多弱化非洲猪瘟病毒接种都不能够良好地抵抗亲本非洲猪瘟病毒的攻毒。鲜有致弱非洲猪瘟病毒接种猪有效抵抗多种非洲猪瘟强毒攻毒的报道。

技术实现思路

1、本发明利用野猪肾细胞(boar kidney cells)bk2258对基因i型和ii型重组非洲猪瘟病毒株(js/lg/21株)进行连续传代93代，再将f93回归原代猪肺泡巨噬细胞(primaryporcine alveolar macrophages，pam)传10代，获得了非洲猪瘟病毒js/lg/21株的细胞传代适应株(即，js4821株)。用该细胞传代适应株js4821株接种的猪无体温升高，无精神沉郁、采食下降、皮肤溃烂或关节肿大等不良临床症状，且该接种的猪能同时抵御基因i型和ii型重组非洲猪瘟病毒强毒株(js/lg/21株)和基因ii型非洲猪瘟病毒流行强毒株(hlj/18株)的攻击。具有交叉保护效果的人工致弱非洲猪瘟病毒株鲜有报道。js4821株具有开发疫苗的巨大应用价值。

2、为了解决现有技术中存在的问题，本发明第一方面提供了一种非洲猪瘟病毒毒株，所述非洲猪瘟病毒毒株是微生物保藏号为cctcc no:v2023100的非洲猪瘟病毒毒株。

3、本发明第二方面提供了一种用于预防、减缓或控制非洲猪瘟的疫苗组合物，所述疫苗组合物以本发明第一方面所述的非洲猪瘟病毒毒株为免疫原。

4、在一些实施方式中，所述疫苗组合物为活疫苗组合物。

5、在一些实施方式中，所述疫苗组合物的原料包括所述非洲猪瘟病毒毒株和辅料。

6、在一些实施方式中，所述辅料为冻干保护剂。

7、在一些实施方式中，在所述疫苗组合物的原料中，所述冻干保护剂为含4-12w/w％明胶和30-50w/w％蔗糖的水溶液。

8、在一些实施方式中，在所述疫苗组合物的原料中，所述非洲猪瘟病毒毒株与所述冻干保护剂的干重用量比为1-20×106.0tcid50：1g。

9、在一些实施方式中，所述非洲猪瘟病毒毒株的tcid50是基于原代猪肺泡巨噬细胞培养采用免疫荧光分析方法根据reed-muench法计算的。

10、本发明第三方面提供了本发明第二方面所述疫苗组合物的制备方法，所述制备方法为：以所述非洲猪瘟病毒毒株为免疫原，制备所述疫苗组合物。

11、在一些实施方式中，所述制备方法为：将所述非洲猪瘟病毒毒株与所述冻干保护剂混合以得到混合物，将所述混合物冷冻干燥以得到所述疫苗组合物。

12、在一些实施方式中，所述冷冻干燥的温度变化程序为：-4到-6℃，0.8-1.2小时；-35到-45℃，1.5-2.5小时；-14到-18℃，14-18小时；-5到-7℃，2-4小时；4-6℃，1.5-2.5小时；26-30℃，5-7小时。

13、本发明的优点：

14、1.获得了能够在bk2258细胞上稳定增殖的传代毒株asfv js4821株。

15、2.细胞传代毒株asfv js4821株接种猪后不发热，无临床症状。

16、3.细胞传代毒株asfv js4821株能同时抵御同源强毒株js/lg/21株(基因i型)和异源强毒株hlj/18株(基因ii型)的攻击，具有asfv不同基因型交叉保护效果。