利用慢病毒载体表达非洲猪瘟B119L基因及其构建方法和应用

本发明属于分子生物学，具体涉及利用慢病毒载体表达非洲猪瘟b119l基因及其构建方法和应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟(asf)是非洲猪瘟病毒(asfv)感染家猪和野猪引起的一种以急性、高热为主要特征的高度接触性传染病，该病病程较短，死亡率高达100％，给国内养猪业带来严重的威胁和巨大的经济损失。根据临床症状，该病可分为最急性、急性、亚急性和慢性4种类型。asfv的自然宿主包括家猪、野猪和钝缘软蜱，钝缘软蜱被病毒感染后，会呈现持续感染状态，终生携带病毒，因此，其不仅是asfv的储存宿主还是重要的传播媒介，同时野生虻也是asfv的潜在病媒生物。非洲猪瘟被世界动物卫生组织(oie)列为法定通报的动物传染病，被我国列为一类动物传染病。asfv是一种有囊膜的二十面体对称的病毒颗粒，直径为172～220nm，从内到外依次为对称的内核、内核心壳、内膜、衣壳和囊膜，大小为170～190kb，含150～167个开放阅读框(open reading frame，orf)，编码54种以上结构蛋白和100多种非结构蛋白。b119l蛋白属于巯基氧化酶的erv1p/alrp家族，是asfv正确组装所必需的晚期非结构蛋白，该蛋白编码基因缺失会导致强毒株的毒力衰减，可对亲本毒株攻击诱发保护性免疫反应，但具有不同程度的残余毒性。

2、由于asf的高致死性和高传染性，且暂时没有有效的疫苗，为防止疫病的传播，需要实施严格的卫生和生物安全控制措施，而这就依赖于疫病的快速、可靠的早期诊断。目前，asf的实验室诊断包括动物接种、病毒分离、病毒核酸dna检测和特异性抗体检测等方法。然而，动物接种、病毒分离和病毒核酸dna等检测方法或需要在生物安全三级以上的实验室，或需要专业的仪器设备和技术人员，或操作繁琐，难以满足基层检疫部门的需要。因此，利用重组asfv抗原建立快速、安全的诊断和检疫方法是十分必要的。近年来，随着asfv全基因组测序的完成，国内外学者利用基因工程技术表达了部分asfv重要的结构蛋白(如p30、p54、p72和cd2v等)，并利用表达的重组蛋白用于asfv血清学诊断用抗原的研究。现有技术中普遍存在抗原产量低，检测方法复杂，对非洲猪瘟的抑制性差等问题。

3、慢病毒(lentivirus)是逆转录病毒的一种，可用于感染依靠传统转染试剂瞬转难于转染的细胞系，如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。与病毒和全病毒疫苗相比，基于重组蛋白的亚单位疫苗相对稳定，且易于使用重组蛋白技术生产，使其成为一种有吸引力的疫苗平台。此外，缺乏活性病毒成分将亚单位疫苗的疾病风险降至最低，显示出非凡的安全性。经cmv启动子控制的hek 293t哺乳动物细胞表达系统可实现重组蛋白的高表达、蛋白的翻译后修饰和正确的蛋白折叠络合，表达产物具有良好的免疫原性和安全性，弥补了原核表达系统表达蛋白的低纯度、免疫原性和cho表达系统表达蛋白的不足。

4、因此，为了克服上述问题，亟需一种稳定高效表达b119l的细胞株，以实现b119l高效表达，为疫苗生产或致病机理研究提供平台。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种重组慢病毒载体。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种重组慢病毒。

3、本发明第三方面的目的，在于提供一种细胞。

4、本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的重组慢病毒载体、本发明第二方面的重组慢病毒、本发明第三方面的细胞在制备b119l蛋白或构建高表达b119l蛋白的细胞模型中的应用。

5、本发明第五方面的目的，在于提供一种b119l蛋白的制备方法。

6、本发明第六方面的目的，在于提供本发明第一方面的重组慢病毒载体、本发明第二方面的重组慢病毒、本发明第三方面的细胞制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒引发的疾病的产品中的应用。

7、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

8、本发明的第一个方面，提供一种重组慢病毒载体，在慢病毒载体pcdh-cmv-mcs-ef1α-copgfp的xbaι和notι酶切位点之间插入b119l目的基因片段，即为重组慢病毒载体。

9、在本发明一些实施方式中，所述b119l目的基因片段是以非洲猪瘟核酸为模板，利用引物b119l-f和b119l-r扩增得到。

10、在本发明一些实施方式中，所述引物b119l-f和b119l-r的核苷酸序列如seq idno:1～2所示。

11、本发明的第二方面，提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒是本发明第一方面的重组慢病毒载体与慢病毒辅助包装质粒共转染宿主细胞后得到的包装体。

12、在本发明一些实施方式中，所述慢病毒辅助包装质粒包括ppackh1-gag、pvsv-g和ppackh1-rev。

13、在本发明一些实施方式中，所述重组慢病毒载体与所述ppackh1-gag、pvsv-g和ppackh1-rev的质量比为1:(0.1～0.7):(0.1～0.5):(0.1～0.4)。

14、在本发明一些优选实施方式中，所述重组慢病毒载体与所述ppackh1-gag、pvsv-g和ppackh1-rev的质量比为1:0.5:0.3:0.2。

15、在本发明一些实施方式中，所述宿主细胞包括人肾上皮细胞。

16、本发明的第三方面，提供一种细胞，所述细胞已用本发明第二方面的重组慢病毒转染，所述细胞不包括人或动物的胚胎干细胞、生殖细胞和受精卵。

17、在本发明一些实施方式中，所述细胞包括人肾上皮细胞。

18、本发明的第四方面，提供本发明第一方面的重组慢病毒载体、本发明第二方面的重组慢病毒、本发明第三方面的细胞在制备b119l蛋白或构建高表达b119l蛋白的细胞模型中的应用。

19、本发明的第五方面，提供一种b119l蛋白的制备方法，包括以下步骤：采用本发明第三方面的细胞表达并纯化浓缩得到b119l蛋白。

20、本发明的第六个方面，提供本发明第一方面的重组慢病毒载体、本发明第二方面的重组慢病毒、本发明第三方面的细胞制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒引发的疾病的产品中的应用。

21、在本发明一些实施方式中，所述产品还包括佐剂、免疫增强剂、免疫调节剂或疫苗。

22、本发明的有益效果是：

23、本发明提供了一种可表达b119l蛋白的重组慢病毒载体，将该重组慢病毒载体与慢病毒四质粒系统共转染至人胚胎肾上皮细胞(hek-293t)进行慢病毒包装，可稳定表达b119l蛋白。通过稳转hek-293t细胞系，收集上清液，纯化后得到b119l蛋白，其蛋白的表达时间和水平可以人为的控制，纯化便捷，且该b119l蛋白具有良好的免疫原性，可以为进一步开展研究非洲猪瘟慢病毒载体疫苗提供可靠平台。

技术特征：

1.一种重组慢病毒载体，其特征在于，在慢病毒载体pcdh-cmv-mcs-ef1α-copgfp的xbaι和notι酶切位点之间插入b119l目的基因片段，即为重组慢病毒载体。

2.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒是权利要求1所述重组慢病毒载体与慢病毒辅助包装质粒共转染宿主细胞后得到的包装体。

3.根据权利要求2所述的重组慢病毒，其特征在于，所述慢病毒辅助包装质粒包括ppackh1-gag、pvsv-g和ppackh1-rev。

4.根据权利要求3所述的重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒载体与所述ppackh1-gag、pvsv-g和ppackh1-rev的质量比为1:(0.1～0.7):(0.1～0.5):(0.1～0.4)。

5.根据权利要求3所述的重组慢病毒，其特征在于，所述宿主细胞包括人肾上皮细胞。

6.一种细胞，其特征在于，所述细胞已用权利要求2～5中任一项所述的重组慢病毒转染，所述细胞不包括人或动物的胚胎干细胞、生殖细胞和受精卵。

7.权利要求1所述重组慢病毒载体、权利要求2～5中任一项所述的重组慢病毒、权利要求6所述的细胞在制备b119l蛋白或构建高表达b119l蛋白的细胞模型中的应用。

8.一种b119l蛋白的制备方法，包括以下步骤：采用权利要求6所述的细胞表达并纯化浓缩得到b119l蛋白。

9.权利要求1所述重组慢病毒载体、权利要求2～5中任一项所述的重组慢病毒、权利要求6所述的细胞制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒引发的疾病的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品还包括佐剂、免疫增强剂、免疫调节剂或疫苗。

技术总结
本发明属于分子生物学技术领域，公开了利用慢病毒载体表达非洲猪瘟B119L基因及其构建方法和应用，具体公开了一种重组慢病毒载体。本发明提供了一种可表达B119L蛋白的重组慢病毒载体，将该重组慢病毒载体与慢病毒四质粒系统共转染至人胚胎肾上皮细胞(HEK‑293T)进行慢病毒包装，可稳定表达B119L蛋白。通过稳转HEK‑293T细胞系，收集上清液，纯化后得到B119L蛋白，其蛋白的表达时间和水平可以人为的控制，纯化便捷，且该B119L蛋白具有良好的免疫原性，可以为进一步开展研究非洲猪瘟慢病毒载体疫苗提供可靠平台。

技术研发人员：王晓虎,赵梦坡,张翩,陈晶,向华,黄元,蔡汝健
受保护的技术使用者：广东省农业科学院动物卫生研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17