一种促进杜鹃兰种子萌发的小鬼伞属庭院小鬼伞菌及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种促进杜鹃兰种子萌发的小鬼伞属庭院小鬼伞菌及其应用。

背景技术：

1、兰科植物是世界上最珍贵的野生植物资源之一，具有巨大的经济价值。兰科植物多数种是著名的药用植物，具有很高的药用价值，随着中药现代化的快速发展，对兰科药用植物的市场需求越来越大。但由于兰科植物种子细小，仅具有未分化的原胚，没有胚乳，在自然条件下难以萌发，使得兰科植物的人工栽培相当困难。有研究表明，自然状态下大多需要特定的真菌与兰科植物种子形成共生关系，兰科植物种子才能萌发。

2、杜鹃兰(cremastra appendiculata)为兰科杜鹃兰属植物，是名贵、珍稀的药用植物，其干燥假鳞茎被称为山慈菇，具有清热解毒、活血化瘀、抗肿瘤等功效，有很高的药用价值，药材市场需求量巨大。但杜鹃兰种子萌发不易，且生长周期过长，导致资源稀缺。

3、杜鹃兰为地生兰，其菌根真菌的种类和数量相当丰富，这也必然导致菌根真菌与杜鹃兰植物体之间存在着复杂的关系。基于杜鹃兰菌根真菌种类和数量丰富这一特点，研究人员进行了大量研究，证实了菌根真菌能够与杜鹃兰种子形成共生关系从而促进萌发。本发明通过大量研究，从菌根分离获得真菌，成功筛选出来一种有效促进杜鹃兰种子萌发的真菌，该真菌感染能力强，为优势菌，能够大大缩短杜鹃兰种子的萌发时间，提高杜鹃兰种子的萌发率。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种有效促进杜鹃兰种子萌发的真菌菌株；通过菌根分离获得真菌，将真菌与杜鹃兰种子进行共生培养，成功筛选出来一种有效促进杜鹃兰种子萌发的新的真菌-小鬼伞属庭院小鬼伞菌。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、本发明提供了一种促进杜鹃兰种子萌发的小鬼伞属庭院小鬼伞菌菌株，所述小鬼伞属庭院小鬼伞菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2023年1月10日，保藏编号为cctcc m 2023060，其分类命名为coprinellus xanthothrix，归属于小鬼伞属庭院小鬼伞菌(coprinellus xanthothrix)；

4、本发明所述的真菌(小鬼伞属庭院小鬼伞菌)菌株通过分离杜鹃兰菌根真菌群获得，将在野外采集的杜鹃兰菌根洗净后消毒，后用无菌刀切开，切面置于pda培养基上，待菌丝长出后，分离边缘真菌菌丝培养得到20株菌株，分别纯化4次后获得纯净菌株，将这些菌株分别用于杜鹃兰种子萌发实验，筛选出一株能明显促进杜鹃兰种子萌发的菌株。

5、将上述能明显促进萌发的菌株重新活化，将活化后的纯净菌株接种在pda培养基上纯培养，对菌落进行形态观察。菌落在pda培养基上生长速率为0.312±0.004mm/h，所述菌落呈圆形，呈淡黄色，气生菌丝稀疏较粗。菌落边缘整齐，初生菌丝白色、紧贴培养基表面，老化菌丝浅黄稀薄。显微镜下观察可见菌丝呈树枝状向外生长，显微镜下初生菌丝显银白色，带光泽，较密集明显。

6、将上述重新活化的菌株，采用真菌基因组dna提取试剂盒提取菌株dna，以its1/its4序列为引物进行pcr扩增。将pcr产物送至上海生工生物工程有限公司纯化测序。

7、测序结果如下：扩增引物为通用的its1和its4；

8、正向引物its1：tccgtaggtgaacctgcgg，如seq id no:2所示；

9、反向引物its4：tcctccgcttattgatatgc，如seq id no:3所示；

10、扩增序列为：

11、attgatatgcttaagttcagcgggtagtcctacctgatttgaggtcaaattg

12、tcaaggtattgtcctcgcggacggttagaagcgagtctgatcctcgtccac

13、ggcgtagataattatcacaccaatagacggaagttcagtatgaactcgctaa

14、tgcatttcaggggagcggaccgccgtgaggcagcctgcacaaacccccac

15、atccaagcctcgaagaacagttcagaaaactggtgaggttgagaatttaa

16、tgacactcaaacaggcatgctcctcggaataccaaggagcgcaaggtgcg

17、ttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatt

18、tcgctgcgttcttcatcgatgcgagagccaagagatccgttgctgaaagtt

19、gtatagtgttttataggctgagaagcccattgactacattctgcatcatacta

20、ttggggtgtgtaaaaagacgtagagcctggaaattcgaggggagccgtgt

21、gacgggcaaccctcgcatccgccccatgaagggcgagaggtatccagacc

22、tacagtcggtgcacaggtggaaagataaaaatggcgggcgtgcacattgc

23、tccgaggagccagctacaaccaagacaccatagttattcgttaatgatccttccgcaggttcacctacg，如seq id no:1所示；pcr长度为681bp左右；

24、将测定的序列提交至ncbi数据库(登录号：or186295)，进行blast比对，当序列与数据库中的序列之间同一性大于99％，认为是同一属和种。该真菌序列与数据库中小鬼伞属庭院小鬼伞的序列同一性大于99％，故认为该真菌为小鬼伞属庭院小鬼伞(coprinellusxanthothrix)。

25、另外，申请人在燕麦培养基中得到了该菌的子实体，符合庭院小鬼伞特征，而与其他已知的鬼伞类真菌有明显区别，以下简称该子实体为“庭院小鬼伞”。

26、在本发明中，所述庭院小鬼伞菌株的扩大培养方法，优选包括以下步骤：

27、将所述庭院小鬼伞菌株接种在pdb液体培养基上，经培养至其菌丝长满实验器皿即可。所述接种量优选为取庭院小鬼伞菌种0.5cm*0.5cm的小块对应一个100mlpdb液体培养基。

28、本发明还提供了一种用于杜鹃兰种子萌发的产品，包括所述庭院小鬼伞菌株和可接受的辅料。所述产品优选包括植物菌肥和微生物菌剂。本发明对所述植物菌肥和微生物菌剂的制备方法不做特殊限制，采用本领域所熟知的植物菌肥和微生物菌剂的制备方法即可。

29、例如，微生物菌剂的制备方法，优选将上述扩大培养获得的庭院小鬼伞菌的菌丝接种至培养基上，待菌丝长满培养基后，混合，得到微生物菌剂。所述植物菌肥优选是将庭院小鬼伞菌的菌丝接种至培养基上，待菌丝长满培养基后，与营养成分混合，得到植物菌肥。所述培养基优选是pda培养基；所述营养成分优选包括营养元素或有机肥等。

30、本发明还提供了所述的庭院小鬼伞菌在促进杜鹃兰种子萌发中的应用，包括以下步骤：

31、将所述的庭院小鬼伞菌菌种接种在培养基质上，扩大培养备用；

32、所述培养基质具体为：琼脂培养基、土、木头、玉米芯、稻草、麦麸、棉籽壳、树叶、秸秆中的一种或几种组合。

33、将扩大培养所得的菌种与杜鹃兰种子液在共生培养基质中共生培养；

34、所述共生培养基质包括琼脂培养基、土、木头、玉米芯、稻草、麦麸、棉籽壳、树叶、秸秆中的一种或几种组合。

35、本发明还提供了所述用于杜鹃兰种子萌发的产品在促进杜鹃兰种子萌发中的应用。

36、与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：

37、本发明提供了一种促进杜鹃兰种子萌发的小鬼伞属庭院小鬼伞菌及其应用，本发明通过菌根分离获得真菌，成功筛选出来一种能够有效促进杜鹃兰种子萌发的真菌—庭院小鬼伞。实验证明，该真菌菌落在pda培养基上生长速率为0.312±0.004mm/h，生长速度较快，为优势菌，具有较强感染能力；该真菌在燕麦培养基上与杜鹃兰种子共生培养，13～20天左右开始，观察出现原球茎，并计算其萌发率为45.85％±2.4％；45～50天左右开始，观察形成大量原球茎，且出现幼芽；结果表明，该真菌与杜鹃兰种子共生培养能够促进杜鹃兰种子萌发，大大缩短了杜鹃兰种子的萌发时间，提高了杜鹃兰种子的萌发率。除此之外，本方法工艺简单，成本低，生产周期短，可以更加充分地提高经济效益。