与调控茄子果长性状紧密连锁的Indel分子标记及应用

本发明涉及分子遗传育种，特别涉及一种与调控茄子果长性状紧密连锁的indel分子标记及应用。

背景技术：

1、茄子(solanum melongena l.,2n＝24)属于茄科(solanaceae)茄属(solanum)植物，起源于亚洲南部热带地区，是世界各地广泛栽培的一种蔬菜作物。

2、茄子适应范围广、产量大和营养丰富，并且富含维生素、微量元素和多种生物碱，具有降低胆固醇和抑制消化道肿瘤细胞增殖的效果，具有重要的农业经济价值和保健作用。我国因为地理环境和茄子食用偏好差异，导致不同地区对茄子形状和颜色等消费需求差异较大。为了便于新品种茄子的选育，早期性状选育的分子标记就非常重要，然而在茄子的相关研究中，关于果实长度调控的分子标记却不多。

3、分子标记辅助育种涉及的标记有ssr标记、indel标记和snp标记，通过与目标性状或基因紧密连锁的分子标记，通过pcr扩增等技术，利用标记设计的特殊引物序列，将目的片段扩增，通过与已知片段的对比，确认目标性状或基因是否存在相似，从而提前判断作物的表型，在已知表型的基础上，可减少育种工作量，节省育种时间，提高育种效率。

4、公开号为“cn116640872a”的专利文献公开了一种与茄子果实颜色相关的kasp分子标记及其应用。该文献以“ny”和“e802”为亲本，以及杂交群体为材料，对其果实颜色进行统计分析，基于群体基因组重测序筛选出的snp位点构建遗传连锁图谱，并进行茄子果实颜色qtl定位分析；筛选到与茄子果实颜色相关的分子标记位点，为位于8号染色体上80585041位的snp位点；通过该分子标记和引物对，可直接用于茄子果实颜色、果皮中有无叶绿素和对应的基因型的早期鉴定和筛选，从而在苗期就可实现从基因型快速、准确的判断茄子果实颜色性状，为茄子分子辅助育种提供有效的技术支持，同时大大缩短了传统基因定位时间、减少育种工作量和提高育种效率，具有重要的应用价值。但是该专利文献中的方案，无法对茄子果实长度性状育种进行早期鉴定和筛选。

技术实现思路

1、本发明为了解决现有茄子果实长度性状育种过程中所存在的上述技术问题，提供了一种与调控茄子果长性状紧密连锁的indel分子标记及应用，它具有对实现茄子果实长度性状育种早期鉴定和筛选的准确性和可靠性均较好的特点。

2、本发明的第一种技术方案：与调控茄子果长性状紧密连锁的indel分子标记，所述indel分子标记位于茄子3号染色体的主效qtl位点fl3.1内，所述fl3.1为茄子3号染色体71.826mb-78.262mb的物理位置。所述fl3.1通过qtl-seq方法在f2分离群体能检测到，fl3.1所在物理位置为茄子3号染色体71.826mb-78.262mb。本发明开发出与调控茄子果长性状紧密连锁主效qtl位点的indel标记，该标记完全基于主效qtl位点fl3.1，与茄子果实长度性状紧密连锁，将本发明中的indel分子标记用于茄子果实长度的分子标记辅助选择，可大幅提高选择的准确性，缩短育种年限，可以大大提高育种效率，从而加速育种进程；本发明通过对茄子3号染色体的主效qtl位点fl3.1中的核苷酸序列进行indel分子标记开发，也是基于茄子果实长度主效qtl位点indel标记，indel标记完全基于该qtl位点，与茄子果实长度性状紧密连锁，可用于茄子果实长度性状育种的早期分子标记辅助选择，可大幅提高选择的准确性和可靠性，大大缩短育种年限，从而更好的加速育种进程，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。

3、本发明的第二种技术方案：用于获得与调控茄子果长性状紧密连锁的indel分子标记的特异性引物对。本发明基于茄子果实长度的主效qtl位点fl3.1，开发特异性强和稳定性高的引物，indel分子标记位点的多态性表达茄子果实长度差异，预测茄子果实长度差异，为茄子果实长度差异的预先选择提供了可靠的分子标记来源。

4、作为优选，所述特异性引物对的核苷酸序列为，

5、正向引物，f:tttagatacttattgcttaacttc，如seq id no：1所示；

6、反向引物，r:taacagttgaagtaaaatgagaa，如seq id no：2所示。

7、本发明的第三种技术方案：与调控茄子果长性状紧密连锁的分子标记在实现茄子果实长度性状育种早期鉴定和筛选中的应用。本发明在定位的茄子果实长度的主效qtl位点fl3.1内，开发了与茄子果实长度性状紧密连锁的分子标记并验证了标记的可靠性，通过检测该分子标记就可以预测茄子果实长度，为实现茄子果实长度性状的早期鉴定和筛选提供了分子标记辅助选择技术。

8、作为优选，包括以下步骤，

9、(s10)选取长果形茄子亲本、短果形茄子亲本、极端长果f2代单株和极端短果f2代单株的dna，结合亲本高深度重测序数据和参考基因组信息，在主效qtl位点fl3.1内，使用引物设计软件，设计与调控茄子果长性状紧密连锁的indel分子标记引物；

10、(s11)对步骤(s10)所述的indel分子标记引物，利用亲本dna进行pcr扩增，经亲本和极端池筛选后，得出与调控茄子果长性状紧密连锁的分子标记位于茄子3号染色体的主效qtl位点fl3.1内。本发明中对标记的筛选方法操作简便快捷，对检测设备和引物模板质量要求不高，具有试验试剂用量少，速度快，成本低，适合大批次、高通量和自动化的优点，非常适合现代农业分子育种的实现；本发明结合亲本高深度重测序数据和参考基因组信息，先在长果形茄子亲本、短果形茄子亲本、极端长果f2代单株和极端短果f2代单株的主效qtl位点内，经过比对分析发现序列差异，使用引物设计软件，设计与茄子果实长度相关的indel分子标记引物，再利用引物进行pcr扩增，根据目标扩增片段在亲本中存在的差异，获得与调控茄子果长性状紧密连锁的indel分子标记，在定位的茄子3号染色体主效qtl位点fl3.1内，即茄子3号染色体71.826mb-78.262mb的物理位置内，开发了与茄子果实长度性状紧密连锁的分子标记并验证了标记的可靠性，通过检测该分子标记就可以预测茄子果实长度，为实现茄子果实长度性状的早期鉴定和筛选提供了分子标记辅助选择技术；对茄子果实长度目标性状或基因紧密连锁的indel分子标记，通过pcr扩增技术，利用indel分子标记设计的特殊引物序列，将目的片段扩增，并与已知片段的极端长果f2代单株和极端短果f2代单株dna进行对比，确认茄子果实长度的目标性状或基因是否存在相似，从而提前判断茄子果实长度的表型，在已知茄子果实长度表型的基础上，可大大减少育种工作量，节省育种时间，提高育种效率。其中参考基因组选用qingzhen wei，jinglei wang，wuhong wang，etal.2020.a high-quality chromosome-level genome assembly reveals genetics forimportant traits in eggplant，doi:https://doi.org/10.1038/s41438-020-00391-0中发表的基因组。

11、作为优选，步骤(s10)中主效qtl位点fl3.1的获得包括以下步骤，

12、(s04)分别提取极端长果f2代单株、极端短果f2代单株和两个茄子亲本的dna；

13、(s05)分别测定步骤(s04)中极端长果f2代单株dna和极端短果f2代单株dna的浓度值；对dna浓度值的测定选用nanodrop；

14、(s06)根据步骤(s05)中测得的dna浓度值进行dna等量混池后，分别构建长果形l池和短果形s池；

15、(s07)分别对步骤(s06)中l池、s池以及两个亲本的dna进行高深度重测序，利用茄子参考基因组，分别得出snp-index(极端性状l)值和snp-index(极端性状s)值；所述高深度重测序选用illumina测序技术平台；

16、(s08)根据公式△(snp-index)＝snp-index(极端性状l)-snp-index(极端性状s)，计算得出△

17、(snp-index)值；

18、(s09)选取99％置信水平作为筛选阈值，根据△(snp-index)值，得出与茄子果实长度相关的主效qtl位点位于茄子fl3.1内。本发明通过提取极端长果f2代单株、极端短果f2代单株和两个茄子亲本的dna，并测定dna的浓度值，构建长果形l池和短果形s池，通过高深度重测序得出snp-index(极端性状l)值和snp-index(极端性状s)值，经过计算出的△(snp-index)值，并结合筛选阈值，得出与茄子果实长度相关的主效qtl位点位于茄子fl3.1内，为后面进一步筛选组好准备，方法简单，准确性较好。

19、作为优选，所述极端长果f2代单株和极端短果f2代单株的获得，包括以下步骤，

20、(s01)选取长果形茄子亲本和短果形茄子亲本杂交，得茄子f1代；

21、(s02)将步骤(s01)中的茄子f1代自交得茄子f2代，并统计茄子f2代的果实长度；

22、(s03)根据步骤(s02)中茄子f2代的果实长度，选取获得极端长果f2代单株和极端短果f2代单株。

23、作为优选，还包括步骤，

24、(s12)利用indel分子标记，分别选取极端长果f2代单株dna和极端短果f2代单株dna进行扩增，并将扩增产物置于琼脂糖凝胶上进行电泳，并对电泳结果进行比对。本发明中位点位于茄子3号染色体的主效qtl位点fl3.1内，利用引物设计软件，将该序列差异转化为indel标记，通过利用pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳检测试验，实现标记的多态性检验，从而实现对茄子果实长度性状的分子标记辅助筛选。

25、作为优选，所述pcr扩增体系为，正向引物各1μl，反向引物1μl，茄子亲本dna 50μg，rapid taq master mix 12μl，ddh2o补至25μl。反应体系中的各物质，与调控茄子果长性状紧密连锁的indel分子标记的引物扩增提供了良好的反应环境，保证整个扩增过程的顺利完成。

26、作为优选，所述pcr扩增的程序为，95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，38个循环；72℃延伸10min；保存温度4℃。针对与调控茄子果长性状紧密连锁的indel分子标记的引物专门设计，具有更好的扩增效果。

27、作为优选，所述与调控茄子果长性状紧密连锁的indel分子标记主效qtl位点fl3.1由多个群体的qtl定位所得。

28、作为优选，所述引物设计软件为primer5。

29、本发明具有如下有益效果：

30、(1)开发出基于茄子果实长度紧密连锁主效qtl位点的indel标记，该标记完全基于主效qtl位点fl3.1，与茄子果实长度性状紧密连锁，将本发明中的indel分子标记用于茄子果实长度的分子标记辅助选择，可大幅提高选择的准确性，缩短育种年限，可以大大提高育种效率，从而加速育种进程；

31、(2)通过对茄子3号染色体的主效qtl位点fl3.1中的核苷酸序列进行indel分子标记，也是基于茄子果实长度主效qtl位点indel标记，indel标记完全基于该qtl位点，与茄子果实长度性状紧密连锁，可用于茄子果实长度性状育种的早期分子标记辅助选择，可大幅提高选择的准确性和可靠性，大大缩短育种年限，从而更好的加速育种进程，其设计巧妙，检测简便快捷，成本低，不受环境影响，适于大规模推广应用，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。