一种建立农杆菌介导罗勒瞬时转化体系的方法

本发明属于植物基因工程，涉及一种建立农杆菌介导罗勒瞬时转化体系的方法。

背景技术：

1、罗勒(ocimum basilicum)是唇形科罗勒属药食两用的芳香植物，别名九层塔，味似茴香，性温，全草和种子均可入药，主治发热咳嗽、食积不化、蛇虫咬伤、跌打损伤等症状，在我国华东、华南均有分布。罗勒及其提取物在医疗保健、农业、食品等领域有较高研究价值和经济价值。罗勒水提物具明显抗癌、抗菌、降血糖等功能；罗勒精油具有控制农业害虫、熏杀玉米象、缓解珍珠龙胆石斑鱼应激作用等作用，其还可结合保鲜衬垫延长海鲈鱼鱼片的贮藏时间。随着近年来对罗勒研究的深入，需要建立一种简便快速的方法对其基因功能进行分析。

2、瞬时表达体系具有简单便捷、表达量大等优势，可分为电击法、聚乙二醇法、基因枪法、农杆菌渗透法等。其中，农杆菌渗透法作为近年来快速发展的瞬时转化方法，具有操作简单、实验周期短、表达效率高及生物安全性高等众多优点，是优良的瞬时转化方法。该方法已用于建立番茄(solanum lycopersicum)、青蒿(artemisia caruifolia)、茶树(camellia sinensis)、丹参(salvia miltiorrhiza)、兜兰(paphiopedilum maudiae)等植物的瞬时转化体系。瞬时表达体系的建立可为后续罗勒功能基因启动子活性、亚细胞定位、蛋白与基因互作、蛋白与蛋白互作等研究奠定技术基础。

3、目前，罗勒瞬时转化体系尚未明确，导致涉及罗勒转录因子及功能基因的亚细胞定位、互作机理等研究难以开展，因此，建立简单快捷的罗勒瞬时表达体系尤为必要。

技术实现思路

1、本实验旨在提供一种建立农杆菌介导罗勒瞬时转化体系的方法，为后续罗勒基因功能研究提供技术支持。

2、本发明采用的技术方案为：

3、一种建立农杆菌介导罗勒瞬时转化体系的方法，包括：

4、从罗勒叶片下表皮注入侵染液，注射后暗处理0～24小时，所述侵染液中含有od600＝0～0.8并转入植物双元表达载体pbi121的根瘤农杆菌gv3101菌液，0～200μmol/l的as溶液，10mmol/l的mes缓冲液，50mmol/lmgcl2水溶液。

5、优选地，所述侵染液中含有od600＝0.8的菌液，0μmol/l as溶液，10mmol/l mes缓冲液，50mmol/l mgcl2水溶液，并于注射后暗处理24小时。

6、优选地，注射方法具体为：在罗勒叶片下表皮叶脉间用注射器针头轻点，将侵染液用不含针头的无菌注射器经下表皮伤口处缓缓注入叶片，直至注射区域停止蔓延，重复侵染步骤直至叶片被完全侵染。

7、优选地，所述罗勒采用以下方法培养：选取均匀饱满的罗勒种子，播种于装有营养土的盆内，置于25℃、光暗周期16小时光照/8小时黑暗、光照度2 000lx的光照培养箱内培养，出苗后间苗，待其长出4片以上真叶、苗高5.0cm左右时选取长势较好的罗勒苗移栽定植于大盆，培养至生长期备用。

8、优选地，采用冻融法进行农杆菌转化：

9、①取-80℃保存的农杆菌感受态于室温融化，待融化至冰水混合态时插入冰中；

10、②取质粒pbi121 10μl加入感受态gv3101中，于冰上静置5分钟后放入液氮处理5分钟，37℃水浴5分钟后冰浴5分钟；

11、③加入700μl无抗生素的lb液体培养基，将混合液置于28℃振荡培养2～3小时；

12、④将混合液以6 000r·min-1离心1分钟，收集菌体，涂布于kana+50μg/ml、rif+20

13、μg/ml的lb固体培养基平板上，28℃倒置培养72～90小时；

14、⑤从培养完成的平板上挑取单菌落加入10μl lb液体培养基，吹打混匀；进行pcr鉴定，筛选单克隆阳性菌株备用。

15、优选地，以m13 rev：5’-caggaaacagctatgac-3’与m13 fwd：5’

16、-gttttcccagtcacgac-3’为上下游引物进行pcr鉴定。

17、优选地，所述侵染液采用以下方法制备：

18、①将含有pbi121的单克隆阳性菌株接种于kana+50μg/ml、rif+20μg/ml的lb液体培养基，置于28℃，200r·min-1摇床中过夜培养，摇至od600＝1.0左右；

19、②将菌液转移至离心管中，以8 000×r·min-1离心1分钟，弃上清，收集菌体；

20、③用含有10mmol/l mes，50mmol/lmgcl2水溶液的重悬液将农杆菌重悬，调节

21、od600为0～0.8；

22、④向重悬液中加入as母液，配制as浓度分别为0～200μmol/l的侵染液。

23、优选地，所述as母液通过以下方法制备：取as固体0.1962g，加入甲醇溶解，无菌水定容至10ml制备0.1mol/l as母液。

24、本发明的有益效果在于：

25、本发明选取罗勒叶片为材料，β-葡糖醛酸酶基因(gus)为报告基因，采用正交实验对农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、暗处理时间等因素进行分析，结合图像处理快速鉴定gus蛋白显色技术，建立由农杆菌介导的罗勒瞬时表达体系。结果表明，当农杆菌菌液浓度od600＝0.8，暗处理时间＝24小时，乙酰丁香酮浓度＝0μmol/l，共培养4天后，外源gus蛋白表达程度最高。该方法简单易行，可为快速分析罗勒功能基因启动子活性、亚细胞定位等提供支持，在罗勒基因功能的研究方面有良好的应用价值。

技术特征：

1.一种建立农杆菌介导罗勒瞬时转化体系的方法，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述侵染液中含有od600＝0.8的菌液，0μmol/l as溶液，10mmol/l mes缓冲液，50mmol/lmgcl2水溶液，并于注射后暗处理24小时。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，注射方法具体为：在罗勒叶片下表皮叶脉间用注射器针头轻点，将侵染液用不含针头的无菌注射器经下表皮伤口处缓缓注入叶片，直至注射区域停止蔓延，重复侵染步骤直至叶片被完全侵染。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述罗勒采用以下方法培养：选取均匀饱满的罗勒种子，播种于装有营养土的盆内，置于25℃、光暗周期16小时光照/8小时黑暗、光照度2 000lx的光照培养箱内培养，出苗后间苗，待其长出4片以上真叶、苗高5.0cm时选取长势较好的罗勒苗移栽定植于大盆，培养至生长期备用。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用冻融法进行农杆菌转化：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，以m13 rev：5’-caggaaacagctatgac-3’与m13 fwd：5’-gttttcccagtcacgac-3’为上下游引物进行pcr鉴定。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述侵染液采用以下方法制备：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述as母液通过以下方法制备：取as固体0.1962g，加入甲醇溶解，无菌水定容至10ml制备0.1mol/l as母液。

技术总结
本发明提供了一种建立农杆菌介导罗勒瞬时转化体系的方法，选取罗勒叶片为材料，β‑葡糖醛酸酶基因(GUS)为报告基因，采用正交实验对农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮浓度、暗处理时间等因素进行分析，结合图像处理快速鉴定GUS蛋白显色技术，建立由农杆菌介导的罗勒瞬时表达体系。结果表明，当农杆菌菌液浓度OD<subgt;600</subgt;＝0.8，暗处理时间＝24小时，乙酰丁香酮浓度＝0μmol/L，共培养4天后，外源GUS蛋白表达程度最高。该方法简单易行，可为快速分析罗勒功能基因启动子活性、亚细胞定位等提供支持，在罗勒基因功能的研究方面有良好的应用价值。

技术研发人员：钮俊,孙晓钒,王佳,傅钇钧,欧琼键,游慧燕
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17