互隔交链孢霉XJ-FQ72在产细交链孢菌酮酸中的应用

本发明涉及微生物，尤其涉及一种互隔交链孢霉xj-fq72在高产tea毒素的应用。

背景技术：

1、链格孢毒素主要由链格孢属真菌产生，是一类具有基因毒性、细胞毒性和致突变性的一类真菌毒素。目前研究较多的链格孢毒素包括链格孢酚(aoh)、链格孢酚单甲醚(ame)、细交链孢菌酮酸(tea)、腾毒素(ten)、交链孢烯(alt)、细格菌毒素ⅰ、ⅱ、ⅲ和aal毒素等。近年来，全球范围内均有红枣、番茄、苹果等果蔬中报道被tea、aoh、ame、ten等毒素污染；而在上述提到的瓜果蔬菜中，最易受链格孢毒素感染的是番茄及其制品等。tea是一种油状、褐色物质，易溶于多种有机溶剂，能与许多物质发生螯合。作为美国食品药品监督管理局(fda)在有毒化学物质注册中列出的唯一链格孢属毒素，该毒素的特征是检出率低，但产生毒素的能力非常强。tea具有急性及亚急性毒性、胚胎毒性、细胞毒性、致癌性以及致死性。

2、目前，我国仅有出入境检验检疫行业标准《sn/t4259-2015出口水果蔬菜中互隔交链孢菌毒素的测定液相色谱-质谱/质谱法》针对果蔬中常规链格孢毒素的检测，缺少国标检测方法。由于链格孢毒素种类繁多，标准品昂贵，对检测仪器要求高等问题，制约了基层开展链格孢毒素的检测方法的推广。据报道，tea毒素可由多种属的真菌产生，但主要是由链格孢属真菌产生，目前已知的链格孢属真菌中，产毒量较小，难以满足毒素标准品的需求，高产tea毒素的链格孢属真菌较为难得；如何简单有效地制备高纯度的tea毒素标准品一直是本领域尚未有效解决的技术难题。

技术实现思路

1、针对目前已知的链格孢属真菌产毒量小，难以满足毒素标准品的需求，且制备过程复杂，产量低，如何简单有效地制备高纯度的tea毒素标准品一直是本领域尚未有效解决的技术难题。本发明旨在于提供一种互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72在产细交链孢菌酮酸中的应用，从新疆维吾尔自治区塔城地区乌苏市的加工番茄主产园区种的病害番茄中分离获得一株互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72，将该菌株经专用培养基发酵培养7d，接种发酵培养基获得互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72发酵物，发酵物经吸附层析分离获得高纯细交链孢菌酮酸tea，产生tea浓度可达382.31μg/ml，该制备方法简单，有效解决制备高纯度的tea毒素标准品这一行业技术难题。

2、为了达到以上技术效果，本发明通过如下技术方案实现。

3、本发明提供一种互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72在产细交链孢菌酮酸中的应用，该方法具体包括如下步骤：(1)将-80℃甘油管中保藏的互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72单菌落接种于专用培养基中，于27℃恒温培养7d，获得互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72种子；(2)用直径6mm的无菌打孔器于菌落边缘打取菌饼，将菌饼按照质量比7％接种到含有发酵培养基的250ml三角瓶中，于24-28℃，130-160r/min发酵培养7d；(3)离心后收集发酵液，加入60ml酸性乙酸乙酯(含0.25％1m盐酸)，涡旋后离心，收集上清液，利用旋转蒸发仪加压蒸馏至干燥，得到粗提物；(4)将步骤(3)所得粗提物用2ml甲醇溶解，采用薄层层析硅胶柱分离，硅胶柱的型号为sephadex lh-20，用己烷：丙酮：甲醇＝10:3:5(v/v/v)的混合液洗脱后得到17个馏分，柱层析流速为1滴/秒，收集14～26min的馏分，合并后浓缩，获得细交链孢菌酮酸。

4、本发明提供的互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72在产细交链孢菌酮酸中的应用，所述互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmcc no.40624。

5、上述互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72是从新疆维吾尔自治区塔城地区乌苏市的加工番茄主产园区种的病害番茄中筛选分离，经its rdna序列系统发育分析和形态学分析，菌株xj-fq72属于互隔交链孢。通过对该菌株基因测序，所得序列在ncbi网站进行blast比对分析，菌株xj-fq72的its基因序列与互隔交链孢菌alternaria alternataisolatenas-aa12(no.kx768145.1)的相似度最高，为99.29％。选取同源性较高的序列构建its rdna系统发育树，菌株xj-fq72与alternaria alternata isolatenas-aa12(no.kx768145.1)亲缘关系最近。经过系列多相分类鉴定可知该菌株xj-fq72确定其为alternaria alternata isolate。

6、上述互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72经过上述本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定，结合菌形态学等多相分类系统鉴定分析，证实该菌株xj-fq72属于交链孢菌属的菌，将其命名为互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为cgmcc no.40624，保藏日期：2023年5月12日。

7、本发明提供的互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72在产细交链孢菌酮酸中的应用，所述互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72的基因序列如seq id no：1所示。

8、本发明提供的互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72在产细交链孢菌酮酸中的应用，所述互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72的专用培养基为：葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，蒸馏水定容至1000ml，120℃灭菌30min。

9、本发明提供的互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72在产细交链孢菌酮酸中的应用，所述互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72的发酵培养基为：将籼米用研磨仪打细粉过筛，称取5.6g籼米粉，加入93ml蒸馏水，121℃高压蒸汽灭菌30min。

10、本发明提供的互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72在产细交链孢菌酮酸中的应用，所述步骤(3)中旋转蒸发条件为：真空度≤0.05mpa，温度35～40℃，转速为100～130rpm。

11、本发明提供的互隔交链孢霉(altemaria altemata)xj-fq72在产细交链孢菌酮酸中的应用，所述步骤(2)的培养温度为25℃，发酵的转速为130rpm。

12、通过以上技术方案，本发明得到以下技术效果：

13、本发明利用获得的互隔交链孢霉新菌altemaria altemata xj-fq72发酵生产细交链孢菌酮酸，产量为382.31μg/ml，相对于本领域常见的微生物菌种发酵代谢和化学合成生产的细交链孢菌酮酸产量显著提高、制备方法简单、成本低、发酵周期短、安全性高、污染低，可通过大规模发酵方式实现活性物质的大量生产，从而从根本上解决药源短缺。