一种IL-21与sCD4及Fc的融合蛋白及其应用

本发明属于基因工程和生物医学医疗，具体涉及il-21、scd4与fc的融合蛋白，包含融合蛋白的药物，以及融合蛋白在预防及治疗hiv感染中的应用。

背景技术：

1、hiv感染除了会导致机体cd4+t数量减少以外，还会诱导机体慢性炎症及免疫耗竭，如诱导cd8+t细胞功能耗竭。目前临床开展的抗逆转录病毒疗法(haart或art)可以有效抑制hiv复制，极大地促进了艾滋病的防治成效。但haart疗法存在以下局限性：1)haart不能彻底清除患者体内hiv病毒，停药后病毒会迅速反弹，患者需终身服药；2)haart治疗并不能让病人的免疫系统恢复到完全正常状态，hiv感染导致的慢性炎症及免疫损伤在一部分患者体内持续存在。因此，目前亟需开发新型治疗策略，达到治愈艾滋病的目的。

2、细胞因子il-21可以增强cd8+t细胞的细胞毒性、效应性和记忆性，并促进nk细胞的存活和活化。研究表明，il-21编程活化t细胞可促进“记忆干细胞样t细胞”的产生，并增强免疫治疗效果(li y,et al.targeting il-21to tumor-reactive t cells enhancesmemory t cell responses and anti-pd-1antibody therapy.nat commun.2021；12(1):951)。此外，il-21可以使cd4+t细胞抵抗treg介导的免疫抑制作用，从而诱导cd4+t细胞的存活和增殖。il-21在控制慢性病毒感染中也发挥重要作用，在慢性病毒感染期间，效应性cd8+t细胞il-21信号有助于防止表型衰竭，并在病毒持续复制时维持其增殖能力(elsaesserh,et al.il-21is required to control chronic viral infection[publishedcorrection appears in science.2009aug21；325(5943):946)。研究表明，在hiv慢性感染过程中，病毒特异性cd4+t细胞可产生il-21，并且与病毒控制相关。hiv特异性的cd8+t细胞在慢性感染中表达高水平的il-21ra，表明病毒特异性cd8+t细胞需要il-21维持其存活和功能，但是，haart治疗并不能恢复il-21的产生，提示cd8+t细胞无法接受有效的il-21刺激信号(yue fy,et al.hiv-specific il-21producing cd4+t cells are induced inacute and chronic progressive hiv infection and are associated with relativeviral control[published correction appears in j immunol.2010aug15；185(4):2632-3；iannello a,et al.dynamics and consequences of il-21production in hiv-infected individuals:a longitudinal and cross-sectional study.j immunol.2010；184(1):114-126)。综上所述，il-21具有增强记忆性cd8+t细胞，特别是“记忆干细胞样t细胞”的功能，并且在体内应用中毒副作用小，可以作为hiv治疗的一个潜在药物。

3、cd4分子作为hiv的受体，它可以与hiv包膜蛋白上gp120结合。cd4分子由四个结构域组成，其中d1d2为胞外结构域，d3d4为胞内结构域。由cd4分子胞外d1d2结构域组成的可溶性cd4分子(scd4)能够结合游离的hiv病毒颗粒。scd4蛋白在人源化小鼠及恒河猴体内能有效预防hiv及shiv感染。除了中和hiv感染功能外，scd4或者cd4的类似物结合被感染细胞表面上的gp120后，可以使hiv包膜蛋白由“封闭”的构象转变为“开放”构象，使其暴露出更多的抗原表位，促进针对hiv包膜蛋白的内源性抗体与gp120结合，从而介导抗体依赖的细胞毒作用(adcc)，清除被感染的细胞。

4、增强机体针对hiv的体液免疫应答也是促进对病毒库杀伤的潜在手段，然而，广谱中和抗体只能在约2％-5％的hiv患者体内产生。通过从这一部分患者分离得到广谱中和抗体，然后利用基因工程手段表达并回输给患者，是实现阻断病毒复制，持久的控制病毒血症的潜在方法。早期的研究显示，广谱中和抗体在hiv感染的人源化小鼠及shiv感染猴子模型体内有良好的治疗效果。临床试验也显示，hiv患者接受了针对hiv胞膜蛋白cd4结合位点的广谱中和抗体3bnc117治疗后，病毒反弹所需时间显著延迟。广谱中和抗体在体内发挥效果需要抗体功能区fc，提示抗体依赖的细胞毒作用对于其发挥功能的重要性。

5、hiv病毒感染导致的机体抗病毒免疫功能耗竭，是hiv无法被有效清除的主要原因。如何有效靶向清除hiv感染细胞，是艾滋病治疗的难点，也是该领域目前待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种hil-21与scd4及fc的融合蛋白及其应用，在实验中观察到，其可以促进记忆干细胞样cd8+t细胞的分化，中和游离病毒，靶向潜伏库细胞，增强cd8+细胞杀伤功能，能够更好的抑制hiv复制。hil-21×scd4-fc融合蛋白可作为新一代的hiv免疫治疗药物。

2、本发明目的通过以下技术方案来实现：

3、本发明提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包含细胞因子hil-21、scd4及免疫球蛋白fc区(fc)三个功能元件。所述的融合蛋白为异源二聚体hil-21×scd4-fc，其包含第一多肽和第二多肽，第一多肽与第二多肽不同；第一多肽自n端至c端顺序包含hil-21、免疫球蛋白fc区(hil-21-fc6)，第二多肽自n端至c端顺序包含scd4、免疫球蛋白fc区(scd4-fc9)。第一多肽包含的免疫球蛋白fc区与第二多肽包含的免疫球蛋白fc区由具有相同亚型的免疫球蛋白突变而来。功能元件之间可通过linker连接。

4、所述的hil-21选自人il-21(seq id no.5)。

5、所述的scd4由hiv受体蛋白cd4胞外区d1d2结构域组成，所述的cd4可选自cd4分子以及cd4的各种分子的突变体，如cd4q40a、cd4g38a、cd4k46a、cd4p48q、cd4e85a等。所述的scd4的氨基酸序列优选如seq id no.11所示。

6、所述的免疫球蛋白fc区可选自igg1、igg2、igg3或igg4的恒定区氨基酸序列，优选来自igg1的突变体fc6(seq id no.7)或fc9(seq id no.9)。其中igg1具有较强的诱导adcc和cdc效应的能力和较长的血清半衰期，是抗体药最常见的抗体亚型；igg2、igg4具有较弱的诱导adcc和cdc效应的能力，但血清半衰期较长。

7、优选的，所述的异源二聚体hil-21×scd4-fc的第一多肽的氨基酸序列如seq idno.1所示，第二多肽的氨基酸序列如seq id no.3所示。

8、本发明的融合蛋白具有如下效果：将hil-21×scd4-fc施用于人外周血单核细胞(pbmc)，可以促进记忆干细胞样cd8+t细胞的分化。将hil-21×scd4-fc施用于被激活的hiv潜伏感染细胞系，在体外可以靶向被激活的hiv潜伏感染细胞。将hil-21×scd4-fc施用于thp-1细胞系，可以靶向thp-1细胞表面的fcr。将hil-21×scd4-fc施用于游离hiv，在体外可以中和游离的hiv病毒，阻断其感染靶细胞。将hil-21×scd4-fc施用于病毒库激活的潜伏感染细胞系，可以促进hiv患者内源性抗体结合到感染细胞表面，具有潜在促进adcc功能。将hil-21×scd4-fc施用于haart治疗来源的pbmc，可以抑制hiv复制，更好的杀伤p24+t细胞。

9、本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明所述的融合蛋白hil-21×scd4-fc。

10、编码所述异源二聚体hil-21×scd4-fc的第一多肽的核酸分子的核苷酸序列优选如seq id no.2所示；编码第二多肽的核酸分子的核苷酸序列优选如seq id no.4所示。

11、本发明提供了一种载体，所述载体包含了上述核酸分子。

12、本发明提供了一种细胞，所述细胞包含本发明所述融合蛋白hil-21×scd4-fc、编码融合蛋白的核酸分子或表达所述融合蛋白的载体，用于生产融合蛋白。所述细胞选自非人哺乳动物细胞，优选cho和hek293细胞。

13、本发明提供了所述的融合蛋白、核酸分子、载体和/或细胞在制备预防或治疗hiv感染的药物中的应用；所述hiv感染优选为hiv急性或慢性感染患者；更优选为经过临床抗逆转录病毒疗法(haart)治疗的hiv患者。

14、本发明提供一种预防或治疗hiv感染的药物，所述药物包含上述融合蛋白、核酸分子、载体或细胞。

15、术语及定义

16、除非特别说明，本技术中所使用的术语和定义均为本领域中惯常使用的含义并且为本领域技术人员知晓。

17、如本技术中所使用的，术语“hiv病毒库”是指hiv潜伏感染或低水平复制的细胞，这类细胞整合了hiv基因组，但是不发生或以较低水平发生hiv的转录和相关蛋白的合成，但是在特定的条件下，会重新起始hiv的复制，并且产生具有复制和感染能力的hiv。

18、本发明所述的“hiv感染”主要是hiv-1感染；hiv-1的病毒可以选jr-csf、t278-50、242-14、t250-4、ho86.8、du422.01、x2088.c9、6322.v4.c1、6471.v1.c16、6631.v3.c10、620345.c1等多种毒株。

19、本发明所述“应用”或“用途”，既可以以疾病预防或治疗为目的的应用，也可表示非治疗目的的应用，例如科学研究等。

20、本发明的有益效果：

21、(1)本发明提供的hil-21×scd4-fc融合蛋白，数据显示可以促进活化的cd8+t细胞分化为记忆干细胞样t细胞。

22、(2)本发明提供的hil-21×scd4-fc融合蛋白，数据显示可靶向地结合被激活的hiv潜伏感染细胞。

23、(3)本发明提供的hil-21×scd4-fc融合蛋白，数据显示可高效结合fc受体。

24、(4)本发明提供的hil-21×scd4-fc融合蛋白，数据显示可有效的中和游离的hiv病毒，阻断新的感染。

25、(5)本发明提供的hil-21×scd4-fc融合蛋白，数据显示可有效促进内源性抗体结合到hiv+细胞表面，具有潜在促进adcc的功能。

26、(6)本发明提供的hil-21×scd4-fc融合蛋白，数据显示在体外可以有效的抑制haart治疗患者的hiv复制。

27、(7)本发明提供的hil-21×scd4-fc融合蛋白，数据显示可有效地促进haart治疗患者的cd8+t细胞更好的杀伤p24+t细胞。