一种酶固定化多肽自组装水凝胶及其制备方法和应用

本发明涉及水凝胶用途领域，特别是涉及一种酶固定化多肽自组装水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、酶又叫做生物催化剂，与一般的非生物催化剂相比，它们都能降低反应的活化能，促进反应的进行，但是酶的催化效率比一般催化剂高出很多，而且酶具有不同于一般催化剂的显著特点：酶对底物具有高度特异性，酶具有可调节性及不稳定性。酶的这种特性，使得其作用条件较温和，只能在适宜的条件下催化反应的进行。

2、酶作用条件温和的性质限制了其在更多工业条件下复杂环境中的应用。比如：有机相生物催化具有抑制水依赖性副反应、增加非极性底物溶解度、进行逆水解反应和利于酶与产品分离等优势，因此有机溶剂中的酶促反应在工业上具有广阔的应用前景。但是由于酶在有机溶剂中的活性较低且不稳定，蛋白酶在工业有机介质中的应用能力受到限制，需对酶进行适应性改造。提高酶在有机溶剂中稳定性最简单的方法就是酶固定化。

3、固定化酶与水溶性游离酶相比会影响固定化酶的催化活性，所以选择合适的固定化方法非常重要。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用，因此对一些反应不适用。而且由于没有共价键连接载体材料与酶，酶的泄露风险比较大。化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来，而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。化学固定方法的优势是得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用，缺点是载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。

4、任何一种方法都同时具有优势和局限性，应根据底物性质、酶分子组成和化学特性选择合适的固定方法。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种酶固定化多肽自组装水凝胶及其制备方法和应用，使用多肽自组装水凝胶对酶进行固定，多肽由氨基酸构成所以具有很好的生物安全性，能够扩展其在生物甚至体内方面的应用。多肽水凝胶通过氢键或静电作用力等弱相互作用力与酶联系，可以降低对酶结构的影响，减少对酶催化能力的破坏。而且酶可以在水凝胶形成的过程中自发固定在纤维“水泥”中，无需额外添加其它试剂，这既减少对酶结构的破坏又能够降低使用成本。总之，多肽水凝胶作为固定化材料具有包裹方便，环境友好，条件温和等优势。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种酶固定化多肽自组装水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

4、1)将前体分子与缓冲液混合，调节ph值为7.4后，与被固定酶、碱性磷酸酶混合，得到混合液；

5、2)将所述步骤1)得到的混合液孵育，得到酶固定化多肽自组装水凝胶；

6、所述前体分子为fmoc-py-ome，结构如式i所示：

7、

8、优选的，所述步骤2)孵育的条件包括：温度为37℃，时间为2h。

9、优选的，所述步骤1)被固定酶包括亮氨酸氨基肽酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和聚对苯二甲酸乙二醇酯降解酶中的一种或几种。

10、优选的，所述步骤1)前体分子的质量与缓冲液的体积比为1mg:25μl。

11、优选的，所述步骤1)缓冲液与被固定酶的体积比为1:1，所述被固定酶的浓度为0.4mg/ml。

12、优选的，所述步骤1)混合液中碱性磷酸酶的浓度为10u/ml。

13、优选的，所述缓冲液为pbs缓冲液，ph值为1.0～9.0。

14、本发明还提供了一种上述技术方案所述制备方法制备得到的酶固定化多肽自组装水凝胶。

15、本发明还提供了上述技术方案所述的酶固定化多肽自组装水凝胶在对酶在酸性条件下保护中的应用。

16、本发明还提供了上述技术方案所述的酶固定化多肽自组装水凝胶在对酶在高温条件下保护中的应用，所述高温的温度为50～70℃。

17、酶固定化多肽自组装水凝胶，其前体分子特征在于含有9-芴甲氧羰基(fmoc-)，酪氨酸(tyr，y)的酚羟基与磷酸基团相连，且羧基与甲酸酯化形成甲酯。其中的酪氨酸本发明设计了l,d两种构型。前体分子经碱性磷酸酶(alp)作用后失去磷酸基团，自发组装为纤维，形成水凝胶。前体分子与成胶分子的结构式见图5。

18、该成胶前体分子为白色粉末，由于酪氨酸的所有亲水基团均被保护起来，所以该化合物十分疏水，不溶于ph 7.4的pbs溶液。加入alp之后，切去磷酸基团，化合物依旧不溶，但自组装为纳米纤维，在宏观上从溶液变为水凝胶状态见图6。

19、在微观上从颗粒变为纳米纤维，见图7。

20、本发明的有益效果为：

21、本发明使用多肽自组装水凝胶对酶进行固定，多肽由氨基酸构成所以具有很好的生物安全性，能够扩展其在生物甚至体内方面的应用。多肽水凝胶通过氢键或静电作用力等弱相互作用力与酶联系，可以降低对酶结构的影响，减少对酶催化能力的破坏。而且酶可以在水凝胶形成的过程中自发固定在纤维“水泥”中，无需额外添加其它试剂，这既减少对酶结构的破坏又能够降低使用成本。总之，多肽水凝胶作为固定化材料具有包裹方便，环境友好，条件温和等优势。

技术特征：

1.一种酶固定化多肽自组装水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)孵育的条件包括：温度为37℃，时间为2h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)被固定酶包括亮氨酸氨基肽酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和聚对苯二甲酸乙二醇酯降解酶中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)前体分子的质量与缓冲液的体积比为1mg:25μl。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)缓冲液与被固定酶的体积比为1:1，所述被固定酶的浓度为0.4mg/ml。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)混合液中碱性磷酸酶的浓度为10u/ml。

7.根据权利要求1、4或5所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为pbs缓冲液，ph值为1.0～9.0。

8.一种权利要求1～7任一项所述制备方法制备得到的酶固定化多肽自组装水凝胶。

9.权利要求8所述的酶固定化多肽自组装水凝胶在对酶在酸性条件下保护中的应用。

10.权利要求8所述的酶固定化多肽自组装水凝胶在对酶在高温条件下保护中的应用，所述高温的温度为50～70℃。

技术总结
本发明提供了一种酶固定化多肽自组装水凝胶及其制备方法和应用，涉及水凝胶用途领域。将前体分子与缓冲液混合，调节pH值为7.4后，与被固定酶、碱性磷酸酶混合，将混合液孵育，得到酶固定化多肽自组装水凝胶。使用多肽自组装水凝胶对酶进行固定，多肽由氨基酸构成所以具有很好的生物安全性，能够扩展其在生物甚至体内方面的应用。多肽水凝胶通过氢键或静电作用力等弱相互作用力与酶联系，可以降低对酶结构的影响，减少对酶催化能力的破坏。而且酶可以在水凝胶形成的过程中自发固定在纤维“水泥”中，无需额外添加其它试剂，这既减少对酶结构的破坏又能够降低使用成本。

技术研发人员：高洁,王中秋
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/25