一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005及其应用的制作方法

本发明属于微生物，具体涉及一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005及其应用。

背景技术：

1、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)是一种厌氧杆菌，革兰氏染色呈阳性。起初是由美国病理学家w.h.welchii等从一高度腐烂的尸体血管组织中分离获得，人们便以他的名字来命名，故又被称为魏氏梭菌。后来因国际细菌命名法规的变动其学名历经多次修订，并最终更名为产气荚膜梭菌。该菌菌体长为3μm-9μm，宽为0.6μm-2.4μm，两端钝圆呈粗杆状，边缘笔直。菌体形态并不固定，往往在菌体生长的早期呈球状，而到生长末期，由于培养基营养成分的耗尽，常出现蝌蚪状、丝状和颗粒状。镜下可见单个或成短链排列，有时也会成对分布。

2、该菌能够产生多种强烈的外毒素，目前已知的有α、β、ε、γ、η、δ、ι、θ、κ、λ、μ，和ν十二种。其中最重要的是α、β、ε、ι这四种外毒素，且均为蛋白质，具有酶活性、抗原性。它们是最主要的致死性毒素和分型毒素。根据分泌的主要外毒素不同，可以将产气荚膜梭菌分为：a-e 5个毒素型，各毒素及菌型都可不同程度地引发动物和人发病。

3、在临床上，传统治疗产气荚膜梭菌病的基本方法是采用抗生素。近些年，随着抗菌药物的大量使用，尤其在我国，抗生素作为饲料添加剂长期添加于饲料中，使得致病菌产生耐药性，而且耐药谱不断扩大，传播速度也越来越快，严重威胁着人们的健康和公共卫生安全。但是随着抗生素的滥用，耐药菌株的出现，治疗产气荚膜梭菌病的目前遇到了很大的困难。

4、噬菌体又称细菌病毒，是一种在细菌体内完成增殖，通过裂解细菌将自身释放到环境中的微生物。与抗生素治疗相比，噬菌体治疗具有代谢效率低、杀死细菌的最低剂量低、高度的特异性、高效的杀菌效果、筛选速度快等优势。

5、近年来，有关噬菌体的研究有了巨大的发展，国内外对噬菌体的应用研究范围很广，包括针对人类疾病的防治、动物疾病的防治、食品中病原菌的清除、农作物的细菌感染防治、细菌生物被膜的裂解等方面。虽然噬菌体应用前景巨大，但不容忽视的是，噬菌体往往具有较窄的宿主谱，一种噬菌体通常只能裂解一种细菌。而且，噬菌体在实际生产应用过程种多采用口服的方式，噬菌体经过消化道时，胃酸等成分容易使噬菌体失活。

6、目前尚未出现能够预防和治疗产气荚膜梭菌病的耐酸碱的噬菌体产品，因此，研发一种可耐强酸强碱、裂解谱宽、兼具预防和治疗，且效果显著、稳定遗传的噬菌体产品用于治疗产气荚膜梭菌病迫在眉睫。

技术实现思路

1、本发明旨在针对现有技术的不足，提供一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005及其应用。本发明提供的一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005可耐强酸强碱，保证了噬菌体的活性不会丧失，可以替代抗生素，可抵抗胃酸的腐蚀，对宿主肠道疾病得到有效治疗，同时该噬菌体对环境友好。

2、本发明上述目的通过以下技术方案实现：

3、第一方面，本发明提供了一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005，该噬菌体从山东某发病养殖场的病禽盲肠中分离得到的，于2023年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.45449。

4、通过电镜观察到：该噬菌体rdp-cp-22005有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约46nm，有一个长约22nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据病毒分类国际委员会(ictv)的分类标准鉴定，其形态符合有尾病毒目的特征，该噬菌体属于短尾病毒科。

5、该噬菌体rdp-cp-22005在moi＝0.1条件下培养8h，其效价高达7.93×109pfu/ml。

6、该噬菌体在ph为2.0-13.0条件下处理2h仍能够保持自身稳定性，在强酸强碱环境下仍然具有较高的活性，对宿主菌依然保持较高的裂解作用，相较于其他现有的噬菌体，耐酸碱能力强；基于上述优异的生物学特征，该噬菌体能够适应强酸和强碱严苛的环境。

7、该噬菌体传代30次的过程中，始终保持较高的效价，没有出现明显波动，说明该噬菌体可以稳定遗传，适宜于大规模工业生产。

8、该噬菌体对产气荚膜梭菌有较好的裂解作用，经过实验证明，其对产气荚膜梭菌的裂解率高达90.9％，且能裂解a型、b型、c型、d型、e型多种血清型的宿主，例如在本发明的实施例中，对所选的a型产气荚膜梭菌的裂解率达到82.4％(17株能裂解14株)，对所选的b型产气荚膜梭菌的裂解率达到100％(6株均能裂解)，对所选的c型产气荚膜梭菌的裂解率达到90.9％(11株能裂解10株)，对所选的d型产气荚膜梭菌的裂解率达到100％(5株均能裂解)，对所选的e型产气荚膜梭菌的裂解率达到100％(5株均能裂解)。这说明本发明的噬菌体rdp-cp-22005对多种血清型的产气荚膜梭菌均有优异的裂解性能，具有较宽的裂解谱，裂解范围和应用对象更广，其在杀灭环境中的产气荚膜梭菌以及防治产气荚膜梭菌引起的疾病方面具有很好的应用前景。

9、第二方面，基于同一个发明构思，本发明还提供了一种杀菌组合物，包括如上所述的产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005。

10、第三方面，基于同一个发明构思，本发明还提供了产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005或如上所述的杀菌组合物在制备以下至少一种产品中的应用：(1)杀灭或抑制产气荚膜梭菌的产品；(2)预防和/或治疗产气荚膜梭菌所引起的家禽疾病的产品；(3)预防和/或治疗产气荚膜梭菌引起的炎症反应的产品。优选的，本发明提供了产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005或如上所述的杀菌组合物在制备预防和/或治疗产气荚膜梭菌所引起的家禽疾病的产品中的应用。优选的，所述家禽为鸡。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。

11、第四方面，基于同一个发明构思，本发明还提供了一种噬菌体药物制剂，所述噬菌体药物制剂的有效成分包括如上所述的产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005。

12、如上所述的噬菌体制剂，所述噬菌体制剂中还包含药学上可接受的载体，所述药物制剂形式为口服给药型或者注射给药剂型。优选的，所述噬菌体药物制剂形式为口服给药型，噬菌体在实际生产应用过程中采用口服给药的方式，噬菌体经过消化道时，胃酸等成分容易使噬菌体失活，但是本技术的发明人意外的发现，该噬菌体rdp-cp-22005可耐强酸强碱，保证了噬菌体的活性不会丧失，而且达到预防或者治疗产气荚膜梭菌病的作用。

13、本发明的有益效果是：

14、1、本发明提供的一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005，在ph为2.0-13.0条件下具有良好的耐酸碱性，可耐强酸强碱，保证了噬菌体的活性不会丧失。该噬菌体可以替代抗生素，抵抗胃酸的腐蚀，对宿主肠道疾病得到有效治疗，同时该噬菌体对环境友好。

15、2、本发明提供的一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005，具有较宽的裂解谱，对44株来源于山东省、江苏省、黑龙江省、河北省等不同地域的产气荚膜梭菌裂解率高达90.9％，应用范围广，为工业化生产噬菌体以及提供用于预防和治疗产气荚膜梭菌引起的疾病提供了噬菌体来源。

16、3、本发明提供的噬菌体从自然界获得，可以稳定遗传，适宜于大规模工业生产，而且使用安全，绿色环保。