抑制产气荚膜梭菌感染的融合蛋白及其相关生物材料与应用
【专利摘要】本发明公开了抑制产气荚膜梭菌感染的融合蛋白及其相关生物材料与应用。该融合蛋白为a)或b)或c)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第51?937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。该融合蛋白免疫动物后可使动物产生较高的血清抗体水平，并且可抵抗产气荚膜梭菌的攻击。该融合蛋白可溶性好，纯化简易，可作为诊断抗原、制备成单克隆抗体或进一步对蛋白功能与构象关系进行研究。
【专利说明】
抑制产气荚膜梭菌感染的融合蛋白及其相关生物材料与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域中抑制产气荚膜梭菌感染的融合蛋白及其相关生物材 料与应用。
【背景技术】
[0002] 产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)也称魏氏梭菌，是一种重要的人畜共 患病，该病原是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及羊快疫、羔羊痢疾、牛羊坏死性肠炎、 牛羊肠毒血症的主要病原之一，对畜牧业造成了巨大的经济损失。产气荚膜梭菌主要的致 病因素是其分泌的外毒素，种类多达13种，其中α、β和ε是最主要的外毒素，根据产生外毒素 的种类不同，可将产气荚膜梭菌分为43、(：、04这五个血清型。目前产气荚膜梭菌病的免疫 主要通过传统的经过灭活的单价苗、多联苗或者类毒素疫苗而实现，这些传统疫苗虽然能 够诱导动物产生一定的保护性抗体，但是它们存在安全性不高、稳定性差、免疫后副反应大 等缺点，这些缺点大大限制了其应用，研发一种针对多种血清型的基因工程亚单位多价疫 苗因而成为了世界各国研究者的重点研究目标。由于基因工程亚单位多价疫苗含有产生保 护性免疫应答所必需的有效免疫成分，去除了与免疫无关的成分，因而相对于传统疫苗而 言安全性、稳定性更好，同时也消除了传统疫苗成分中的热原与应激原、变应原等反应原， 很好的解决了传统疫苗免疫后动物出现的副反应与炎性刺激反应等问题。
[0003] 宫旭颖等（宫旭颖等.产气荚膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达及 免疫原性研究.中国预防兽医学报.第37卷第2期2015年2月）利用PCR技术构建了含有α、β和 ε融合基因的重组质粒，并且进行了 α-β2_ε融合蛋白的诱导表达，为进一步研制多价基因工 程亚单位苗提供了基因材料，为解决困扰我国畜牧业的动物坏死性肠炎和肠毒血症提供了 一条新的途径。但是该重组质粒表达出的α_β2-ε融合蛋白为包涵体结构，且α-β2-ε融合蛋 白的表达量占菌体总蛋白含量的18.4%。
[0004] 现有技术中对产气荚膜梭菌主要外毒素蛋白的表达与纯化方法相对复杂，表达产 物通常以不溶性的包涵体形式存在，可溶性蛋白表达的报道在国内外非常少。因为包涵体 中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一 个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高。这是限制其应用的主 要制约因素。采用可溶性表达方式可很好的克服这一问题。如何构建可溶性表达载体并且 优化可溶性蛋白的高效表达方法，是本领域长期以来一直研究的热点课题。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的一个技术问题是如何获得抑制产气荚膜梭菌感染的可溶性蛋 白质疫苗。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供了 a)或b)或c)或d)的蛋白质：
[0007] a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008] b)由SEQ ID No.2第51-937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009] C)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；
[0010] d)将SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加得到的可溶性蛋白质。
[0011] 上述蛋白质中，a)的蛋白质名称为a-P2-e-his，b)的蛋白质名称为α-β2-ε』Ε0 ID No. 2由937个氨基酸残基组成。
[0012] 上述蛋白质中，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的 一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。
[0013] 上述蛋白质中，所述蛋白质可按照包括如下步骤的方法制备:使所述蛋白质的编 码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质;所述生物为微生物、植物或非人动物。
[0014] 上述蛋白质中，使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述的蛋白质 的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表 达得到所述蛋白质。
[0015] 上述蛋白质中，所述受体微生物可为Cl) -C4)中的任一种：
[0016] C1)原核微生物；
[0017] C2)革兰氏阴性细菌；
[0018] C3)埃希氏菌属细菌；
[0019] C4)大肠杆菌 BL21(DE3)〇
[0020] 上述蛋白质中，所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因：
[0021] 1)编码序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子(编码a-02-e-his);
[0022] 2)编码序列是SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的DNA分子(编码α-β2_ε);
[0023] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
[0024] 其中，SEQ ID No.l由2820个核苷酸组成，其名称为cH32-e-hisY基因，编码氨基酸 序列是SEQIDNo.2的蛋白质a-β2-ε-his。SEQIDNo.l的第151-2814位所示的DNA分子是 α-β2-ε-Υ基因，编码由SEQ ID如.2第51-937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质€1-02^。 [0025] 上述蛋白质中，所述重组微生物为将ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ导入大肠杆菌BL21(DE3)得 到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21 (DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y，所述 ρΕΤ30α-α-β2-ε-Υ 为将载体 pET30a( + )的 BamHI 和 Xhol 位点之 间的序列替换为SEQ ID No. 1第151-2814位(编码α-β2_ε)所示的DNA片段得到的重组载体。 [0026] 上述蛋白质中，所述表达为诱导表达，所述诱导表达是用0.75mM的IPTG在16°C诱 导13-16小时或13-24小时或13小时或16小时。
[0027] D1)或D2)的应用也属于本发明的保护范围：
[0028] D1)所述蛋白质在制备产气荚膜梭菌病诊断抗原中的应用；
[0029] D2所述蛋白质在制备单克隆抗体中的应用。
[0030] 与所述蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围，所述生物材料可为下述 B1)至B16)中的任一种：
[0031] B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
[0032] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0033] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
[0034] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0035] B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
[0036] B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[0037] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0038] B8)含有Μ)所述重组载体的重组微生物；
[0039] Β9)含有Β1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
[0040] Β10)含有Β2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
[00411 Β11)含有Β3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0042] Β12)含有M)所述重组载体的转基因动物细胞系；
[0043] Β13)含有Β1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0044] Β14)含有Β2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0045] Β15)含有Β3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
[0046] Β16)含有M)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0047] 上述生物材料中，所述核酸分子可为如下1)或2)或3)所示的基因：
[0048] 1)编码序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子(编码a-02-e-his);
[0049] 2)编码序列是SEQ ID No.l的第151-2814位所示的DNA分子(编码α-β2_ε);
[0050] 3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。 [0051 ] 上述生物材料中，所述重组载体可为所述ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ;
[0052] 所述重组微生物可为El)或Ε2):
[0053] E1)所述重组微生物为将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所 述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物为Cl)-C4)中的任一种：
[0054] C1)原核微生物；
[0055] C2)革兰氏阴性细菌；
[0056] C3)埃希氏菌属细菌；
[0057] C4)大肠杆菌 BL21(DE3)。
[0058] E2)所述重组微生物为将所述ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表 达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物。
[0059] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0060]这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或 计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％) 表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0061 ] 本发明将SEQ ID No.l的第151-2814位所示的DNA分子插入pET30a( + )的BamHI和 XhoI位点，得到表达SEQIDNo.2的重组蛋白α-β2-ε-his的重组表达载体pET30a-α-β2-ε-Y。将重组表达载体ρΕΤ30 &-α-β2-ε-Υ导入大肠杆菌BL21(DE3)获得了可溶性的目的蛋白α-β 2_e-his。本发明优化了 a-02_e-his的表达条件，进一步提尚了 a-02_e-his的表达量，用 0.75mM的IPTG在16°C诱导13-16小时，a-02_e-his的含量达到菌体总蛋白的65%，表达的a-02-e-his 92%可溶。a-02_e-hisY免疫动物后可使动物产生较高的血清抗体水平，并且可 抵抗产气荚膜梭菌的攻击。a-i32-e-his在抵抗A型产气荚膜梭菌攻击时的7天内的免疫保护 率为100%，PBS对照组小鼠全部死亡;α-β2-ε-1?s在抵抗B型产气荚膜梭菌攻击时的免疫保 护率为1〇〇%，？83对照组小鼠全部死亡;免疫€^2-￡-11&在抵抗(：型产气荚膜梭菌攻击时的 免疫保护率为90%，？83对照组小鼠全部死亡;€1邻2-￡-11&在抵抗0型产气荚膜梭菌攻击时 的免疫保护率为1〇〇%，而PBS对照组小鼠全部死亡。第三次免疫cH32-e-his后7-14天抗体 效价达到峰值，最高抗体效价达1:128000 w-PS-e-hisY可溶性好，纯化简易，可作为诊断抗 原、制备成单克隆抗体或进一步对蛋白功能与构象关系进行研究。
【附图说明】
[0062]图1为各菌株表达蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。
[0063] 图中，Μ为Marker，从上到下分别为 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、 26KD;1、诱导表达的受体菌全菌蛋白液体，2、未诱导表达的BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y全 菌蛋白液体，3、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_Y全菌蛋白液体，4、诱导表达的BL21 (DE3 )/ρΕΤ30&-α-β2_ε-Υ 含蛋白上清液，5、诱导表达的 BL21 (DE3 )/ρΕΤ30&-α-β2_ε-Υ 含蛋白 沉淀，6、未诱导表达的BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-W全菌蛋白液体，7、诱导表达的BL21 (DE3)/pET30a-a-P2_e-W 全菌蛋白液体，8、诱导表达的 BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W 含蛋白 上清液，9、诱导表达的BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-W含蛋白沉淀，10、未诱导表达的BL21 (DE3)/pET3Oa-pma-02_e-W 全菌蛋白液体，11、诱导表达的 BL21(DE3)/pET3Oa-pma-02_e-W 全菌蛋白液体，12、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pmcH32-e-W含蛋白上清液，13、诱导表达 的 BL21(DE3)/pET30a-pmα-β2-ε-W含蛋白沉淀。
[0064] 图 2 为Western-blot 图谱。
[0065]图中，1、诱导表达的受体菌全菌蛋白液体，2、未诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-β2-ε-Υ全菌蛋白液体，3、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-Y全菌蛋白液体，4、诱导表 达的 BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y 含蛋白上清液，5、诱导表达的 BI^UDESVpETSOa-a-PS-e-Y 含蛋白沉淀， 6、未诱导表达的 BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W 全菌蛋白液体， 7、诱导表达 的 BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W 全菌蛋白液体，8、诱导表达的 BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W 含蛋白上清液，9、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_W含蛋白沉淀，10、未诱导表达的 BL21 (DE3) /pET3Oa-pma-02_e -W 全菌蛋白液体，11、诱导表达的 BL21 (DE3) /pET3Oa-pma-02_ ε-W全菌蛋白液体，12、诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pma-P2-e-W含蛋白上清液，13、诱导 表达的 BL21(DE3)/pET30a-pma-P2_e-W 含蛋白沉淀。
[0066]图3为重组蛋白a-P2_e-his的AKTA纯化鉴定。箭头所指的为纯化的目的蛋白峰。 [0067]图4为重组蛋白a-i32-e-his的分子筛纯化鉴定与结构初步判定。箭头所指的为纯 化的目的蛋白峰。
[0068]图5为纯化的目的蛋白的SDS-PAGE电泳图谱。
[0069] 其中 1 是 BL21 (DE3)/pET30a-a-P2_e-Y 含蛋白沉淀；2是BL21 (DE3)/pET30a-a-P2_ ε -Y全菌蛋白液体;Μ是Marker，从上到下分别为 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、 26KD; 3是受体菌全菌蛋白液体;4是BL21 (DE3) /ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ含蛋白上清液;5是镍柱纯 化目的蛋白样品；6是纯化的a-K-e-his蛋白（分子筛纯化目的蛋白样品）。
[0070] 图6为摸索BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y不同诱导温度与时间点的对比电泳图。箭 头示目的条带。
[0071] 其中 Μ是Marker，从上到下分别为 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、 26KD;1是37°C诱导lh后的全菌蛋白液体;2是37°C诱导2h的全菌蛋白液体;3是37°C诱导4h 的全菌蛋白液体;4是37 °C诱导5h的全菌蛋白液体;5是16 °C诱导13h的全菌蛋白液体;6是16 °C诱导24h的全菌蛋白液体。箭头示目的条带。
[0072] 图7为BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y不同IPTG浓度条件的对比电泳图。箭头示目的 条带。
[0073]其中Μ是Marker，从上到下分别为 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、26KD (5yL); 1是16 °C、0.1 mM诱导后的全菌蛋白液体;2是16 °C、0.3mM诱导后的全菌蛋白液体;3是 16 °C、0.5 mM诱导后的全菌蛋白液体;4是16 °C、0.7 5 mM诱导后的全菌蛋白液体;5是：16 °C、 ImM诱导后的全菌蛋白液体;6是无诱导剂空白对照。
[0074] 图8为BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y不同诱导温度的对比电泳图。
[0075]其中Μ是Marker，从上到下分别为 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、26KD (5μυ;1是低温16°C诱导13h后提取的含蛋白上清液;2是低温16°C诱导16h后提取的含蛋白 上清液。
【具体实施方式】
[0076]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0077] pET30a( + )为 Novagen 公司产品。pET28a( + )为 Novagen 公司产品。
[0078] A型产气荚膜梭菌强毒株C57_10、B型产气荚膜梭菌强毒株C58_5、C型产气荚膜梭 菌强毒株C59-4、D型产气荚膜梭菌强毒株C60-11均为中国兽医药品监察所产品。
[0079] 实施例1、可溶性表达a-02-e-his
[0080] 1、合成基因
[0081 ] 本申请设计了3种融合基因，分别为SEQ ID No.l所示的a-02_e-hisY基因 、SEQ ID No·3所示的a-β2-ε-hisW基因、SEQIDNo·4所示的pma-β2-ε-hisW基因。
[0082] a-β2-ε-hisY基因和a-β2-ε-hisW基因均编码SEQIDNo.2所示的蛋白质a-β2-ε-his<3pma _02_e-hisW基因编码SEQ ID No·5所不的蛋白质ρπια_β2_ε-hisW<3a_02 _e-his是将 pma-P2-e-hisW的第52-146位氨基酸残基、464-492位氨基酸残基和743-750位氨基酸残基 缺失得到的蛋白质。
[0083]用化学合成的方法合成出SEQ ID No.l的第151-2814位所示的α-β2-ε_Υ基因（编 码SEQ ID No.2的第51-937位氨基酸残基所示的蛋白质），SEQ ID No.3的第151-2814位所 示的a-β2-ε-W基因（编码SEQIDN0.2的第51-937位氨基酸残基所示的蛋白质），SEQID No.4的第151-3210位所示pma-02-e-W基因（编码SEQ ID No.5的第51-1069位氨基酸残基所 示的蛋白质pma-02-e-W)。
[0084] 2、重组表达载体和重组菌的构建
[0085] 以a - β 2 - ε - Υ基因作为模板，利用上游引物F 1 (序列为5 ' -g g a t c c 8七区1:1:1:七区区区&。。。区区&。&。。区&。-3'）和下游弓丨物1?1(序列为5'-CTCGAGTCATTTGATGCCCGGTGCTTTGA-3'）进行 PCR 扩增，在 α-β2-ε-Υ 基因的两端加上 BamHI 位 点（带下划线的序列）和XhoI识别位点（带下划线的序列），得到SEQ ID No. 1的第145-2820 位所示的α-β2-ε-Υ基因 PCR产物。
[0086] 以α -β 2- ε -W基因作为模板，利用上游引物F 1和下游引物R2 (序列为5 ' -CTCGAGTCATTTGATACCCGGCGCTTTGA-3'）进行 PCR 扩增，在 a-g2-e-ff 基因的两端加上 BamHI 和 Xhol识别位点，得到SEQ ID吣.3的第145-282〇位所示的€[-02-￡-1基因？0?产物。
[0087] 以p m α - β 2 - ε - W基因作为模板，利用上游引物F 3 (序列为5 ' - g_ gatccatgaaacgcaaaatctgcaaagcc-3'）和下游引物R2进行PCR扩增，在pma-02_e-W基因的两 端加上BamHI和Xho I识别位点，得到SEQ ID No. 4的第145-3216位所示的pma-β2-ε-W基因 PCR产物。
[0088] 将上述α-β2_ε-Υ基因 PCR产物用BamHI和Xhol酶切，回收目的片段（α-β2_ε-Υ基 因）；同时用BamHI和Xho頂每切载体pET30a( + )，回收载体大片段;将回收的目的片段与回收 的载体大片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将其 均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37°C培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用 BamHI和Xhol进行双酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒进行测序，将测序结果表明是用SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的α-β2_ε-Υ基因替换pET30a( + )的BamHI和Xhol识别位点间的 片段，保持pET30( + )的其它序列不变得到的重组表达载体，命名为ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ。 ρΕΤ30α-α-β2-ε-Υ含有带His标签的a-02_e-hisY基因，a-02_e-hisY基因的核苷酸序列是 SEQ ID No.l，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质a-β2-ε-his。将含有pET30a-a-β2-ε-Y的重组 大肠杆菌命名为 BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y。
[0089] 将上述a-02_e-W基因 PCR产物用BamHI和Xhol酶切，回收目的片段（α-β2_ε-Ι基 因）；同时用BamHI和Xho頂每切载体pET30a( + )，回收载体大片段;将回收的目的片段与回收 的载体大片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将其 均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37°C培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用 BamHI和Xhol进行双酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒进行测序，将测序结果表明是用SEQ ID No.3的第151-2814位所示的α-β2-ε-W基因替换pET30a( + )的BamHI和XhoI识别位点间的 片段，保持pET30a( + )的其它序列不变得到的重组表达载体，命名为pET3Oa-a-02-e-W。 pET3Oa-a-02_e-W含有Hi s标签融合蛋白α-β2_ε -hi sW基因，α-β2_ε -h i sW基因的核苷酸序列 是SEQIDNo.3，编码SEQIDNo.2所示的蛋白质a-β2-ε-his。将含有pET30a-a-β2-ε-W的重 组大肠杆菌命名为 BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-W。
[0090] 将上述pma-02-e-W基因 PCR产物用BamHI和Xhol酶切，回收目的片段(ρπια-β2-ε-Ι 基因）；同时用BamHI和Xhol酶切载体pET30a( + )，回收载体大片段;将回收的目的片段与回 收的载体大片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将 其均匀涂布于含卡那霉素的LB平板上，37°C培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用 BamHI和Xhol进行双酶切鉴定，将酶切验证正确的质粒进行测序，将测序结果表明是用SEQ ID No.4的第151-3210位所示的pmα-β2-ε-W基因替换pET30a( + )的BamHI和XhoI识别位点间 的片段，保持pET30( + )的其它序列不变得到的重组表达载体，命名为pET3Oa-pma-02-e-W。 pET3Oa-pma-02_e-W 含有带 His 标签的 pma-02_e-hisW 基因，pma-02_e-hisW 基因的核苷酸序 列是SEQ ID Νο·4,编码SEQ ID Νο·5所示的蛋白质pma-02-e-hisW。将含有pET30a-pma-P2-ε-W 的重组大肠杆菌命名为 BL21(DE3)/pET3Oa-pma-02_e-W。
[0091] 3、蛋白表达形式的分析与鉴定
[0092] 将BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e-Y、BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W、BL21(DE3)/ pET3Oa-pma-02-e-W和大肠杆菌BL21 (DE3)(简称受体菌)这四个菌株分别单独接种于含50μ g/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μ g/ml得到的培养基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至OD600 值（以含SOμg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，取出1 mL菌液作为未诱 导表达的菌液(对照），其余液体中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。上 述四株菌的诱导表达均是用〇.75mM的IPTG在16°C诱导13小时。
[0093] 取未诱导表达的菌液和诱导表达菌液用于蛋白表达形式分析。具体步骤为，取lmL 菌液置于1.5mL离心管中，做好标记，4°C条件下8000rpm/min离心30min，弃掉上清液，收集 菌体沉淀。加入lmL PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉 淀中加入200yL PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。将全菌蛋白 液体于4°C离心机中16000rpm/min离心30min，分别收集上清液(命名为含蛋白上清液)和沉 淀(命名为含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50此PBS重悬洗涤沉淀。向全菌蛋白液体、含 蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入l〇yL 5XSDS-PAGE loading Buffer，充分混匀后，置沸水 浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6yL用于SDS-PAGE电泳分析，并且结合 蛋白灰度分析软件初步分析蛋白含量。将电泳后的凝胶转印于NC膜，以抗His标签的羊抗鼠 抗体为结合抗体DAB显色，进行Western-blot鉴定。将上述全菌蛋白液体和含蛋白上清液用 0.22μπι滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶剂 是水，PH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个柱体积的溶液1与 10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶剂是水， PH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓 度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗镍柱挂在镍柱上 的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化目的蛋 白样品。
[0094] 将镍柱纯化的目的蛋白样品用GE公司生产的SuperdeX200凝胶柱通过分子筛进一 步纯化。流动相使用溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，收集洗 脱峰，得到分子筛纯化的目的蛋白样品，使用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)对 得到的分子筛纯化的目的蛋白样品中蛋白（即可溶性目的蛋白）的含量进行定量分析。并用 NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)测定全菌蛋白液体中的蛋白质含量，得到菌体总 蛋白含量。将含蛋白沉淀用尿素溶解后，用NanoDrop2000超微量分光光度计(ND2000)测定 含蛋白沉淀中的蛋白质的含量。
[0095] 结果表明诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_Y的全菌蛋白液体、含蛋白上清 液和含蛋白沉淀中均含有大小为105kD的目的蛋白cH32-e-his，未诱导表达的BL21(DE3)/ ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ的全菌蛋白液体中不含有大小为105kD的目的蛋白a-P2-e-his;诱导表达 的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_Y的全菌蛋白液体中的目的蛋白a-P2-e-his占菌体总蛋白 (全菌总蛋白）的65%，诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_Y的含蛋白上清液中的目的 蛋白cH32-e-his占诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e-Y的全菌蛋白液体中目的蛋白a-f32-e-his的92%，该92%的目的蛋白a-P2_e-his为可溶性蛋白；诱导表达的BL21(DE3)/ ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ的含蛋白沉淀中的目的蛋白a-P2-e-his占诱导表达的BL21(DE3)/ ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ的全菌蛋白液体中目的蛋白a-P2-e-his的8%，该8%的目的蛋白α-β2_ε-his为不溶性包涵体蛋白；说明诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_Y的目的蛋白α-β2_ ε-his占菌体总蛋白的65%，BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-Y表达的目的蛋白a-P2_e-his中 92%为可溶性蛋白，8%为不溶性包涵体蛋白。诱导表达的BL21 (DE3)/pET30a-a-P2_e-W的 全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小为105kD的目的蛋白α-β2-ε-1?s， 未诱导表达的BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-W的全菌蛋白液体中不含有大小为105kD的目的 蛋白a-P2-e-his;诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_W的全菌蛋白液体中的目的蛋白 a-P2_e-his占菌体总蛋白的65%，诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W的含蛋白上清 液中的目的蛋白a-K-e-his占诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_W的全菌蛋白液体中 目的蛋白a-f32_e-his的8%，该8%的目的蛋白a-P2_e-his为可溶性蛋白；诱导表达的BL21 (DE3)/pET30a-a-P2-e_W的含蛋白沉淀中的目的蛋白a-P2-e-his占诱导表达的BL21(DE3)/ pET30a-a-P2_e-W的全菌蛋白液体中目的蛋白a-P2_e-his的92%，该92%的目的蛋白α-β2_ ε-his为不溶性包涵体蛋白；说明诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W的目的蛋白α-β 2-e-his占菌体总蛋白的65%，BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W表达的目的蛋白a-P2_e-his中 8%为可溶性蛋白，92%为不溶性包涵体蛋白。未诱导表达的BL21 (DE3)/pET30a-pma-P2-e-W的全菌蛋白液体和诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-pma-P2-e-W的全菌蛋白液体、含蛋白上 清液和含蛋白沉淀中均不含有大小为120KD的目的蛋白pma-P2-e-his;说明BL21(DE3)/ ρΕΤ30α-ρπια-β2-ε-W没有表达目的蛋白ρπια-β2-ε-his。诱导表达的大肠杆菌BL21 (DE3)的全 菌蛋白液体不含有大小为105kD的目的蛋白cH32-e-his;说明大肠杆菌BL21(DE3)没有表达 目的蛋白a-i32-e-his。菌落形成单位(CFU)数量相同的诱导表达的BL21(DE3)/pET30a-a-P 2-ε-Υ和诱导表达的BL21 (DE3)/pET3Oa-a-02-e-W表达的菌体总蛋白质量相同（图1和图2)。 [0096] 4、a-02_e-his 的纯化
[0097] 将BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB 液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液体 培养基为空白对照)达到〇. 6时，加入IPTG进行诱导表达。该诱导表达用0.75mM的IPTG在16 °C诱导13h。取IPTG诱导表达13h后的菌液收集菌体沉淀。加入PBS重悬沉淀，8000rpm/min离 心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘 稠，于4°C离心机中16000rpm/min离心30min，收集上清液(命名为含蛋白上清液），弃沉淀。 将含蛋白上清液用〇. 22μπι滤膜过滤后上样至预先用溶液1 (溶质及其浓度如下：20mM Tris、 150mM NaCl，溶剂是水，pH8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入AKTA机器上，分别用10个 柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪 唑，溶剂是水，PH8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在AKTA机器上监测蛋白峰。用溶液3 (溶质及其浓度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶剂是水，pH8.0的溶液)冲洗镍 柱挂在镍柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍 柱纯化的a-K-e-his蛋白（镍柱纯化目的蛋白样品）（图3)。
[0098] 将镍柱纯化的a-02_e-his蛋白用GE公司生产的Superdex200凝胶柱通过分子筛进 一步纯化。流动相使用溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，α_β2-ε-his蛋白的结构为单体与二聚体共存结构。收集单体与二聚体结构的洗脱峰，得到分子筛 纯化的a-K-e-his蛋白（分子筛纯化目的蛋白样品），使用NanoDrop2000超微量分光光度计 (ND2000)对得到的蛋白的纯度进行定量分析。
[0099]将分子筛纯化的a-i32-e-his蛋白进行质谱分析其氨基酸序列，结果表明α-β2-ε-his的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
[0100] 将BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y和大肠杆菌BL21(DE3)(简称受体菌)这两个菌株 分别单独接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至 卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器 200rpm振荡培养至OD600值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时， 加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)进行诱导表达。上述两株菌的诱导表达均是用 0 · 75mM的IPTG在16 °C诱导13小时。
[0101] 取IPTG诱导表达13h后的菌液用于蛋白表达形式分析。具体步骤为，取lmL诱导后 的重组菌液置于1.5mL离心管中，做好标记，4°C条件下8000rpm/min离心30min，弃掉上清 液，收集菌体沉淀。加入lmL PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的 菌体沉淀中加入200yL PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。将全 菌蛋白液体于4°C离心机中16000rpm/min离心30min，分别收集上清液(命名为含蛋白上清 液)和沉淀(命名为含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50yL PBS重悬洗涤沉淀。向全菌蛋白 液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入l〇yL 5XSDS-PAGE loading Buffer，充分混匀 后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6yL用于SDS-PAGE电泳分 析。同时将上述镍柱纯化目的蛋白样品和上述纯化的a-i32-e-his蛋白（分子筛纯化目的蛋 白样品）进行SDS-PAGE电泳分析。
[0102] 结果表明BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y表达的目的蛋白a-02-e-his以可溶性的形 式存在于细菌破碎菌体的上清液中，可溶性蛋白目的条带表达明显，上清液中杂质较少。通 过对AKTA机器纯化洗脱条件的优化，可以得到纯度更好的可溶性目的蛋白条带，进一步通 过分子筛的纯化后，可以除去蛋白样品中的含有的大量咪唑（图5)，并且首次发现了该融合 重组蛋白的结构为单体与二聚体共存结构。通过分子筛的纯化后的可溶性蛋白可以作为诊 断抗原、制备成单克隆抗体或进一步对蛋白功能与构象关系进行研究。
[0103] 另外，按照上述方法，将pET28a( + )的限制性内切酶Nhel和Notl位点之间的序列替 换为SEQ ID No.l第151-2814位所示的α-β2-ε_Υ基因，保持pET28a( + )的其它序列不变，得 到含有α-β2_ε-Υ基因的重组表达载体，将该重组表达载体命名为ρΕΤ28&-α-β2_ε-Υ。将 ρΕΤ28&-α-β2-ε-Υ转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将得到的重组大肠杆菌命名为BL21 (DE3)/pET28a-a-02_e-Y。将 BL21(DE3)/pET28a-a-02_e-Y 接种于含 50μg/ml 卡那霉素的 LB 液体培养基(在LB液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基） 中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至OD600值（以含50μg/ml卡那 霉素的LB液体培养基为空白对照)达到0.6时，取出lmL菌液作为未诱导表达的菌液(对照）， 其余液体中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)进行诱导表达。该诱导表达是用0.75mM 的IPTG在16°C诱导13小时。取诱导表达的菌液和未诱导表达的菌液按照上述方法进行蛋白 表达形式分析。结果表明，未诱导表达的BL21(DE3)/pET28a-a-02-e-Y全菌蛋白液体、诱导 表达的 BL21(DE3)/pET28a-a-02_e-Y 全菌蛋白液体、诱导表达的 BL21(DE3)/pET28a-a-P2_ ε-Y含蛋白上清液和诱导表达的BL21(DE3)/pET28a-cH32-e-Y含蛋白沉淀中均没有目的蛋 白的表达。可见，虽然采用同一种外源目的基因（α-β2-ε_Υ基因），在不同的BL21(DE3)表达 载体-pET28a( + )和pET30a( + )中，外源目的基因的表达情况相差很大，将α-β2-ε_Υ基因通过 pET30a( + )导入大肠杆菌BL21 (DE3)可获得α-β2_ε-Υ基因的高效可溶性表达，将α-β2_ε-Υ基 因通过pET28a( + )导入大肠杆菌BL21(DE3)中，α-β2_ε-Υ基因却没有表达。
[0104]实施例2、a-02-e-his的动物免疫保护性试验 [0105] 1、抗产气荚膜梭菌疫苗的制备
[0106] 将实施例1中分子筛纯化的a-i32-e-his蛋白用无菌PBS溶解，得到cH32-e-his浓度 为1000yg/mL的a-02-e-his溶液，用于免疫。将a-02-e-his溶液与弗氏佐剂按1:1等体积混 合，乳化制备油乳剂疫苗，将其命名为首免疫苗。将a-i32-e-his溶液与不完全弗氏佐剂按1: 1等体积混合，乳化制备油乳剂疫苗，将其命名为二免疫苗。
[0107] 取出从中国兽医药品监察所购买到的A型产气荚膜梭菌强毒株C57-10、B型产气荚 膜梭菌强毒株C58-5、C型产气荚膜梭菌强毒株C59-4、D型产气荚膜梭菌强毒株C60-11。在超 净工作台中，用75 %酒精棉球仔细擦拭保存菌种的安瓿瓶外壁，然后用砂轮在安瓶的上三 分之一处做一划痕，再用干燥的无菌纱布包裹安瓶将其掰开。吸取400yL厌氧肉肝汤液体培 养基反复吹打安瓶中的菌种，使冻干菌种溶解菌悬液。按照1:100的比例将菌悬液接种到含 有牛肉膏的厌氧肉肝汤的试管中，并在试管上层加盖l-2cm的液体石蜡隔绝空气。将接好菌 的试管放入厌氧培养箱，置37°C恒温培养箱中，培养16-24h后，观察细菌的生长情况。复苏 后的菌种经过涂片、染色、镜检，确认无误后传1-2代后使用，并将一部分菌种用30%的甘油 盐水-80°C冰箱保存。
[0108] 2、A型产气荚膜梭菌攻毒试验
[0109] 按照如下方法测试a-K-e-his对A型产气荚膜梭菌强毒株C57-10的抗性试验：
[0110] 将30只体重在18-22g的雌性昆明小鼠，随机分成2组(攻毒剂量组20只，并设10只 小鼠的PBS对照组）。攻毒剂量组，首次免疫、第二次免疫与第三次免疫均采用皮下注射的方 法进行免疫，首次免疫用首免疫苗，第二次免疫与第三次免疫用二免疫苗，每次免疫剂量均 为0.2mL/只（a-02-e-his免疫剂量为100yg/只）；PBS对照组中的每只小鼠首次免疫、第二次 免疫与第三次免疫，皮下注射〇. 2mL PBS。首次免疫之前，先对小鼠进行一次割尾采血，分离 血清，用作阴性对照血清。首次免疫后，间隔14d进行第二次免疫，二免后14d进行第三次免 疫。第三次免疫两周后每只攻毒剂量组小鼠和每只PBS对照组小鼠腹腔注射1.5 X 109cfu的 A型产气荚膜梭菌强毒株C57-10进行攻毒试验。自一免后开始，每组小鼠每周米血一次，每 组采5只，分离血清，于-80°C冰箱保存，用于检测抗体。采用间接ELISA检测免疫动物抗体水 平，具体方法如下：
[0111] 1)包被:将实施例1中分子筛纯化的a-i32-e-his蛋白用0.05mol/L pH 9.0的碳酸 盐包被缓冲液进行稀释，然后按l〇〇yL/孔逐一加入ELISA板中，将加好的ELISA板置4°C冰箱 中过夜；
[0112] 2)洗涤:从4°C冰箱中取出ELISA板，弃去板孔内的液体，并在滤纸上拍干，向每孔 加入200yL PBST置于洗板机中进行洗版，重复4次。
[0113] 3)封闭：向ELISA板的每个孔中加入100yL含有5%脱脂乳的PBST溶液，放入37°C温 箱孵育lh;
[0114] 4)洗涤：向每孔加入200yL PBST置于洗板机中进行洗版，重复4次；
[0115] 5)加待检血清:将待检血清按比例用灭菌PBS进行稀释，每孔加100yL，同时设阴性 对照、阳性对照和空白对照孔，放入37°C温箱孵育lh;
[0116] 6)洗涤：向每孔加入200yL PBST置于洗板机中进行洗版，重复4次；
[0117] 7)酶标二抗结合:将HRP标记的羊抗鼠二抗用含有5 %脱脂乳的PBS封闭缓冲液按 1:20000-1:40000浓度稀释后，分别向每孔加入100yL，放入37°C温箱孵育lh;
[0118] 8)洗涤：向每孔加入200yL PBST置于洗板机中进行洗板，重复4次；
[0119] 9)显色反应:将新鲜配制的TMB显色液按lOOyL/孔加入到ELISA板的各个孔中，放 入37°C温箱避光显色15min;
[0120] 10)终止反应：向按照50yL/孔加入2mol/L的浓H2S〇4终止液，放入37°C温箱反应 5min，终止显色；
[0121 ] 11)读数:将终止显色的ELISA板放酶标仪中检测0D45Q的值。
[0122] 12)判定检测结果：用确定好的阴阳性临界值来判定检测结果。阳性临界值=阴性 样本的0D45Q平均值+3S(S为标准方差）。待检血清的效价为待检血清的0D值多阳性临界值时 所对应的血清稀释度。
[0123] 3、B型产气荚膜梭菌攻毒试验
[0124] 除了将A型产气荚膜梭菌强毒株C57-10替换为B型产气荚膜梭菌强毒株C58-5，攻 毒剂量调整为2 X 109cfu外，其它操作完全相同。
[0125] 4、C型产气荚膜梭菌攻毒试验
[0126] 除了将A型产气荚膜梭菌强毒株C57-10替换为C型产气荚膜梭菌强毒株C59-4，攻 毒剂量调整为1.5 X 108cfu外，其它操作完全相同。
[0127] 5、D型产气荚膜梭菌攻毒试验
[0128] 除了将A型产气荚膜梭菌强毒株C57-10替换为D型产气荚膜梭菌强毒株C60-11，攻 毒剂量调整为1.8 X 109cfu外，其它操作完全相同。
[0129] 攻毒剂量组和PBS对照组实验小鼠在三免二周后，分别使用各型产气荚膜梭菌 1MLD 100的剂量对小鼠进行攻毒，并于一周内观察和记录小鼠发病死亡情况。攻毒结果表 明，攻毒剂量组(免疫a-i32-e-his)对各型产气荚膜梭菌的攻击均具有一定的免疫保护效 果。攻毒剂量组(免疫a-i32-e-hi s)在抵抗A型产气荚膜梭菌攻击时的7天内的免疫保护率为 100%(20只全部存活），1^5对照组小鼠全部死亡;攻毒剂量组(免疫€^2- ￡-11&)在抵抗8型 产气荚膜梭菌攻击时的免疫保护率为100% (20只全部存活），roS对照组小鼠全部死亡;攻 毒剂量组(免疫〇-敗-￡-11^)在抵抗(：型产气荚膜梭菌攻击时的免疫保护率为90%(18只存 活，2只死亡），PBS对照组小鼠全部死亡;攻毒剂量组(免疫a-i32- e-his)在抵抗D型产气荚膜 梭菌攻击时的免疫保护率为100 % (20只全部存活），而ros对照组小鼠全部死亡。将纯化后 的a-K-e-his作为诊断抗原包被酶标板检测检测小鼠免疫抗原或者攻毒后的血清抗体，发 现a-02- e-his作为诊断抗原建立的检测方法均具有非常好的灵敏性与特异性。分别检测各 实验组中小鼠初免后0-6周的血清中抗体效价水平，结果表明α-β2-ε-1? s融合毒素蛋白免 疫组抗体效价有明显升高，在二免后抗体效价快速上升，三免后7-14天抗体效价达到峰值， 最高抗体效价达1:128000。
[0130]实施例3、a-02-e-his诱导表达条件的优化 [0131] 1、诱导温度和时间的优化
[0132] 将BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB 液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液体 培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)分别进行下述6种诱 导表达。第一种诱导表达是用〇.75mM的IPTG在37°C诱导1小时。第二种诱导表达是用0.75mM 的IPTG在37°C诱导2小时。第三种诱导表达是用0.75mM的IPTG在37°C诱导4小时。第四种诱 导表达是用〇.75mM的IPTG在37°C诱导5小时。第五种诱导表达是用0.75mM的IPTG在16°C诱 导13小时。第六种诱导表达是用0.75mM的IPTG在16°C诱导24小时。
[0133] 取lmL诱导后的重组菌液置于1.5mL离心管中，做好标记，4°C条件下8000rpm/min 离心30min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入lmL PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃 掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入200此PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得 到全菌蛋白液体。向全菌蛋白液体中加入1〇此5XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勾 后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6yL用于SDS-PAGE电泳分 析。结果表明BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y在诱导温度为37°C，诱导时间在l_4h的条件下， a-i32-e-his蛋白表达量随时间延长逐渐上升，5h诱导条件下蛋白表达量有所下降。但是随 着诱导温度的降低，a-i32- e-his表达量也有所增加，当诱导温度降低至16°C，时间为诱导 13h时，a-P2-e-his表达量达到最高，目的蛋白a-P2-e-his占全菌总蛋白的65%。继续培养 至24h，α-β2_ε-his的表达量略有下降，因此，通过实验验证BL21 (DE3)/ρΕΤ30α-α-β2-ε-Y的 最佳诱导温度为16°C，诱导时间为13_24h(图6)。
[0134] 2、IPTG浓度的优化
[0135] 将BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB 液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液体 培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)分别进行下述6种诱 导表达。第一种诱导表达是用O.lmM的IPTG在16°C诱导13小时。第二种诱导表达是用0.3mM 的IPTG在16 °C诱导13小时。第三种诱导表达是用0.5mM的IPTG在16 °C诱导13小时。第四种诱 导表达是用〇.75mM的IPTG在16°C诱导13小时。第五种诱导表达是用ImM的IPTG在16°C诱导 13小时。第六种诱导表达是用OmM的IPTG在16 °C诱导13小时。
[0136] 取lmL诱导后的重组菌液置于1.5mL离心管中，做好标记，4°C条件下8000rpm/min 离心30min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入lmL PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃 掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入200此PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得 到全菌蛋白液体。将全菌蛋白液体于4 °C离心机中16000rpm/min离心30min，收集上清液(命 名为含蛋白上清液），向含蛋白上清液中加入l〇yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混 匀后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6yL用于SDS-PAGE电泳分 析。结果表明a-f32_e-his在不同浓度的IPTG诱导下，表达量也有所不同。cH32-e-his表达量 与加入IPTG浓度在0.1-0.75mM之间呈递增关系。当IPTG诱导浓度为ImM时，蛋白表达量有所 减少，这可能与IPTG本身的毒性有关。因此选择IPTG浓度0.75mM为最佳诱导浓度（图7)。
[0137] 3、诱导时间的优化
[0138] 将BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(在LB 液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0D6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液体 培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)分别进行下述2种诱 导表达。第一种诱导表达是用〇.75mM的IPTG在16°C诱导13小时。第二种诱导表达是用 0 · 75mM的IPTG在16 °C诱导16小时。
[0139] 取lmL诱导后的重组菌液置于1.5mL离心管中，做好标记，4°C条件下8000rpm/min 离心30min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入lmL PBS重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃 掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入200此PBS，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得 到全菌蛋白液体。
[0140] 向全菌蛋白液体中加入10yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混匀后，置沸水 浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6yL用于SDS-PAGE电泳分析。
[0141] 结果表明BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y在诱导温度为16°C，诱导时间在13h与16h 的条件下，目的蛋白a-02-e-his表达量变化不大，此时表达的蛋白几乎均为可溶性蛋白，沉 淀中的不溶性包涵体蛋白几乎没有表达。当诱导温度为16°C，诱导时间在13h与16h的条件 下表达的可溶性目的蛋白纯度较高，表达量接近。因此，通过实验验证，进一步确定了重组 菌的最佳诱导温度为16°C，诱导时间为13-16h(图8)。
【主权项】
1.&)或13)或(3)或(1)的蛋白质： a) 由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质； b) 由SEQ ID No.2第51-937位所示的氨基酸序列组成的蛋白质； c) 在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白； d) 将SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的可溶性蛋白质。2. 根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于:所述蛋白质按照包括如下步骤的方法制 备:使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质;所述生物为微生物、植物 或非人动物。3. 根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于:使所述蛋白质的编码基因在生物中进行 表达包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达权利要求1所述 蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到权利要求1所述蛋白质。4. 根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于:所述受体微生物为Cl )-C4)中的任一种： C1)原核微生物； C2)革兰氏阴性细菌； C3)埃希氏菌属细菌； C4)大肠杆菌BL21(DE3)。5. 根据权利要求2-4中任一所述的蛋白质，其特征在于:所述蛋白质的编码基因为如下 1)或2)或3)所示的基因： 1) 编码序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 编码序列是SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的DNA分子； 3) 与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA 分子。6. 根据权利要求3-6中任一所述的蛋白质，其特征在于:所述重组微生物为将pET30a-α-β2-ε-Y导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQIDN 0.2的蛋白质的重组 微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y，所述ρΕΤ30α-α-β2-ε-Υ为将 载体pET30a( + )的BamHI和Xhol位点之间的序列替换为SEQ ID No.l第151-2814位所示的 DNA片段得到的重组载体。 7. D1)或D2)的应用： D1)权利要求1所述的蛋白质在制备产气荚膜梭菌病诊断抗原中的应用； D2)权利要求1所述的蛋白质在制备单克隆抗体中的应用。8. 与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B16)中的任 一种： B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体； B4)含有B2)所述表达盒的重组载体； B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物； B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物； B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物； B8)含有Μ)所述重组载体的重组微生物； Β9)含有Β1)所述核酸分子的转基因动物细胞系； Β10)含有Β2)所述表达盒的转基因动物细胞系； Β11)含有Β3)所述重组载体的转基因动物细胞系； Β12)含有Μ)所述重组载体的转基因动物细胞系； Β13)含有Β1)所述核酸分子的转基因植物细胞系； Β14)含有Β2)所述表达盒的转基因植物细胞系； Β15)含有Β3)所述重组载体的转基因植物细胞系； Β16)含有M)所述重组载体的转基因植物细胞系。9. 根据权利要求8所述的生物材料，其特征在于:所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示 的基因： 1) 编码序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 编码序列是SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的DNA分子； 3) 与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA 分子。10. 根据权利要求8或9所述的生物材料，其特征在于:所述重组载体为权利要求6中所 述ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ; 所述重组微生物为El)或Ε2): E1)所述重组微生物为将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表 达权利要求1所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物为Cl )_C4)中的任一种： C1)原核微生物； C2)革兰氏阴性细菌； C3)埃希氏菌属细菌； C4)大肠杆菌BL21(DE3)。 E2)所述重组微生物为将权利要求6中所述ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ导入大肠杆菌BL21(DE3) 得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物。
【文档编号】G01N33/569GK106008678SQ201610302778
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月9日
【发明人】宋晓晖, 孙雨, 翟新验, 曲萍
【申请人】中国动物疫病预防控制中心