一株大口黑鲈（Micropterussalmoides）蛙虹彩病毒（Ranavirussp.）及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药，尤其涉及一株大口黑鲈(micropterussalmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)及其应用。

背景技术：

1、自20世纪90年代以来，纳米材料的设计和应用取得了重大突破。许多类型的物质，包括化学药物、蛋白质和疫苗，都可以通过纳米材料进行呈递，以满足较高的生物利用度。渔用疫苗主要通过腹腔、肌肉注射或浸泡的方式进行免疫，若不能被有效摄取，免疫效力仍然很弱。佐剂是提高疫苗免疫原性的有效手段。通过添加佐剂提高疫苗的作用时间，同时利用纳米材料的载体效应，制备高效疫苗是当前渔用疫苗开发的新思路。纳米铝佐剂粒径小、比表面积大、抗原吸附能力强，可诱导机体产生更强的免疫应答，成为国内外研究的热点。有学者发现将纳米铝制成棒状或牙签状后作为佐剂的同时还可以作为一种疫苗载体，能够更好的将抗原提呈到抗原提呈细胞，加强对抗原的细胞吞噬和炎症小体的激活，诱导更强的细胞免疫和体液免疫，提高机体的免疫应答水平。

2、大口黑鲈(micropterus salmoides)，又名加州鲈，原产于北美洲密西西比河流域，自1983年引入我国广东地区后，已经成为我国重要的淡水养殖经济鱼类之一，2022年全国年产量超80万吨(中国渔业统计年鉴，2023)。但从2008年起，每年6～10月，广东养殖的大口黑鲈都会流行病毒性溃疡综合征，表现为皮肤和肌肉坏死溃烂，并伴有脾脏和肾脏变大等症状，死亡率高达60％，给养殖户造成巨大的经济损失。经研究发现，该病毒性溃疡综合征是由一种虹彩病毒科(iridoviridae)蛙病毒属(ranavirus)的病毒感染引起，也称蛙虹彩病毒病。针对蛙虹彩病毒病的防控，国内外已引起众多研究者的关注。疫苗免疫具有绿色、环保等优点，是防控病毒性疾病的重要手段。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一株大口黑鲈(micropterussalmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)及其应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一株大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)，又名largemouth bass ranavirus(lmbv)，属于虹彩病毒科(iridoviridae)蛙病毒属(ranavirus)，所述大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)于2023年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno:v202397，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

4、本发明从广东省佛山市顺德区养殖场患溃疡病大口黑鲈肝脏组织中分离出一株新的大口黑鲈蛙虹彩病毒lmbv-2007064，该lmbv-2007064对鳜鱼脑组织细胞(cpb细胞)更加敏感，可利用cpb细胞增殖lmbv-2007064；利用cpb细胞增殖lmbv-2007064后收获的病毒液病毒滴度约为108.5tcid50/ml。

5、第二方面，本发明提供了所述大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)在制备预防蛙虹彩病毒病的疫苗中的应用。

6、本发明利用大口黑鲈蛙虹彩病毒lmbv-2007064的灭活抗原作为疫苗能够显著抑制lmbv攻毒后的发病率，预防蛙虹彩病毒病，安全性良好，能够提高大口黑鲈脾脏组织il-8、tnf-α、ifn等免疫因子的表达量，提高血清抗体效价。

7、第三方面，本发明提供了纳米氢氧化铝与大口黑鲈蛙虹彩病毒联用在制备预防蛙虹彩病毒病的疫苗中的应用，所述纳米氢氧化铝为长方体形，粒径大小40-200nm。

8、本发明成功筛选到一种可有效提高大口黑鲈蛙虹彩病毒灭活抗原承载和递呈的佐剂-纳米氢氧化铝，相比于微米氢氧化铝以及纳米免疫刺激复合物(iscom)作为佐剂，纳米氢氧化铝作为佐剂对大口黑鲈蛙虹彩病毒lmbv-2007064灭活抗原吸附效果更好，抗原承载效力更高，结合效力更好，纳米氢氧化铝作为佐剂还可以促进树突细胞(dcs)有效地向lmbv灭活抗原物质迁移，显著提高树突细胞对抗原的提呈能力。

9、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述大口黑鲈蛙虹彩病毒为上述大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)，所述的大口黑鲈(micropterussalmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)于2023年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:v202397，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

10、本发明研究发现，与大口黑鲈传染性脾肾坏死病毒(isknv)灭活抗原和大口黑鲈弹状病毒(msrv)灭活抗原相比，纳米氢氧化铝作为佐剂对所述大口黑鲈蛙虹彩病毒lmbv-2007064灭活抗原吸附效果更好，能够显著提高大口黑鲈蛙虹彩病毒lmbv-2007064灭活抗原的承载和递呈。

11、第四方面，本发明提供了一种预防蛙虹彩病毒病的疫苗，包括所述大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)的灭活抗原；所述大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)于2023年10月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no:v202397，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

12、本发明利用大口黑鲈蛙虹彩病毒lmbv-2007064灭活抗原免疫，灭活前病毒含量为108.0～108.5tcid50/ml，灭活后以0.1ml/尾免疫，免疫效果也能达到了100％。

13、作为本发明所述疫苗的优选实施方式，所述疫苗还包括纳米氢氧化铝佐剂；所述纳米氢氧化铝为长方体形，粒径大小40-200nm。

14、本发明发现，纳米氢氧化铝佐剂能将大量大口黑鲈蛙虹彩病毒lmbv-2007064灭活抗原吸附在其表面，吸附效果更好，抗原承载效力更高；同时，能够显著促进树突细胞(dcs)有效地向lmbv-2007064灭活抗原迁移，显著提高dcs对抗原的提呈能力。本发明将纳米氢氧化铝佐剂应用到大口黑鲈蛙虹彩病毒lmbv-2007064灭活抗原制备疫苗，得到的疫苗对大口黑鲈安全性良好，相对免疫保护率可达100％，为大口黑鲈提供100％的保护效果，为预防大口黑鲈蛙虹彩病毒感染提供了有效的防控手段。本发明的蛙虹彩病毒灭活疫苗能够显著提高大口黑鲈脾脏组织il-8、tnf-α、ifn等免疫因子的表达量，具有更高的血清抗体效价及持续期，能够更好的诱导大口黑鲈头肾淋巴细胞的增殖活性，具有良好的免疫活性。

15、作为本发明所述疫苗的优选实施方式，所述大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)的灭活抗原与纳米氢氧化铝佐剂的体积比为(1～2):1。

16、作为本发明所述疫苗的优选实施方式，所述大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)的灭活抗原与纳米氢氧化铝佐剂的体积比为1:1。

17、作为本发明所述疫苗的优选实施方式，所述大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)的灭活抗原的制备方法，包括如下步骤：

18、s1、利用鳜鱼脑组织细胞(cpb细胞)增殖大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)，收获病毒液；

19、s2、将步骤s1得到的病毒液利用甲醛灭活，中和甲醛后，即得大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)的灭活抗原。

20、作为本发明所述灭活疫苗的优选实施方式，所述步骤s1中，将所述大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)按照感染复数(moi)为0.1～0.2接种鳜鱼脑组织细胞(cpb细胞)，然后利用含有胎牛血清的l15液体培养基培养。

21、作为本发明所述灭活疫苗的优选实施方式，所述步骤s1中，将所述大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)按照感染复数(moi)为0.1接种鳜鱼脑组织细胞(cpb细胞)，利用终浓度为2％胎牛血清的l15液体培养基，28℃培养。

22、本发明的大口黑鲈蛙虹彩病毒lmbv-2007064对鳜鱼脑组织细胞(cpb细胞)更加敏感，相比于利用鲤鱼上皮瘤细胞(epc细胞)增殖，利用cpb细胞增殖的病毒滴度更高，达108.5tcid50/ml。

23、作为本发明所述疫苗的优选实施方式，所述步骤s2中，所述病毒液利用甲醛灭活的具体步骤为：将病毒液与甲醛混合至甲醛的终浓度为体积百分比0.2％，28～32℃灭活96～100h；所述中和甲醛是利用焦亚硫酸钠溶液中和。

24、作为本发明所述疫苗的优选实施方式，所述步骤s2中，所述灭活为30℃灭活96h。

25、本发明利用甲醛灭活大口黑鲈蛙虹彩病毒lmbv-2007064，30℃灭活96h，使病毒完全被灭活，灭活样品接种cpb细胞后连续盲传3代，不出现病变。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

27、本发明提供了一株新的大口黑鲈(micropterus salmoides)蛙虹彩病毒(ranavirus sp.)，该病毒的灭活抗原能够作为防治蛙虹彩病毒病的疫苗；纳米氢氧化铝佐剂对该病毒的灭活抗原吸附效果好，抗原承载效力高，结合效力好，能够提高该灭活抗原的承载和递呈；该病毒的灭活抗原与纳米氢氧化铝佐剂混合的灭活疫苗对大口黑鲈安全性良好，为大口黑鲈提供100％的保护效果，为预防大口黑鲈蛙虹彩病毒感染提供了有效的防控手段。