一类异养硝化-好氧反硝化微生物固定化方法

本发明涉及一类异养硝化-好氧反硝化微生物固定化方法，特别是一种利用聚乙烯醇（pva）和海藻酸钠（sa）以及生物炭（bc）等为复合载体固定化菌体的方法，属于固定化微生物。

背景技术：

1、生物脱氮工艺的控制稳定性有待提高，当前的生物法在解决细菌生长缓慢和流失问题上还不够理想，这限制了生化过程的效果。为了改善生物法工艺，需要提高微生物的效率，并在保持细菌菌落活性和浓度的前提下对反应过程进行控制。为了进一步研究和开发微生物工艺，固定化微生物技术应运而生。

2、常见的微生物固定化技术可分为物理法和化学法两大类。物理法主要包括吸附法和包埋法，而化学法主要采用交联法。物理吸附法利用吸附能力强的物质（如活性碳、硅胶等）将微生物固定在载体上。这种方法操作简单，成本低廉，且微生物活性损失较小。然而，由于载体表面积有限，限制了微生物的固定量。此外，微生物与载体之间的作用力较小，容易受水流冲散，从而降低了重复利用率和处理效率。另一种包埋法是固定化微生物最常用的方法。根据包埋系数的结构，可将其分为凝胶包埋和微胶囊法。凝胶包埋是将细胞包裹在凝胶的微小格子内，或者包裹在半透膜聚合物的超滤膜内。该方法成本低，操作简单，但传质阻力大，限制了细胞的催化活性，从而影响微生物的作用。化学交联法通常通过将菌体与各种水凝胶混合，并使用戊二醛交联剂将菌体包裹在载体中。然而，这种方法存在一些缺点。首先，制备过程中需要使用有机试剂，这些试剂具有毒性，对环境和工作人员有一定危害。其次，无法实现规模化的生产制备。此外，水凝胶的包埋会影响菌体与底物的接触，进而影响菌体的活性利用率。

3、因此，为了进一步改善生物法脱氮工艺，需要在固定微生物的方法上进行优化和创新，以提高微生物固定的效率和稳定性。

4、本发明的一个目的是提供一类异养硝化-好氧反硝化微生物固定化方法，其中有一种是以聚乙烯醇（pva）和海藻酸钠（sa）为载体的微生物固定化方法。本发明方法制备条件要求低，设备简单，能耗小，制备过程无毒性污染物产生，对环境、工作人员安全，能实现规模化制备生产；最终制备成的固定化微生物成本低，质量稳定性高。

5、本发明还有一个目的是提供经固定化的异养硝化-好氧反硝化菌的样品扫描检测的方法。

6、本发明的技术方案如下：

7、一类异养硝化-好氧反硝化微生物固定化方法，所述方法包括以下步骤：

8、1）制备固定化载体：将固定化载体原料和无氨去离子水用电磁加热炉制备成溶液；

9、2）制备菌悬液：将一株异养硝化好氧反硝化菌培养于无机盐液体培养基中，并离心重悬；

10、3）制备载体包埋复合体：将步骤1）制作成的固定化载体材料灭菌，冷却到室温后与步骤2）培养得到的菌悬液混合搅拌；

11、4）固定活化交联-包埋复合体：将步骤3）得到的固定化微生物的载体包埋复合体充分混合，加入到交联剂中交联活化复合体，室温静置固化，最后获得交联-包埋化的微生物载体复合体。

12、所述的一类异养硝化-好氧反硝化微生物固定化方法，所述方法包括以下步骤：

13、1）制备固定化载体：以聚乙烯醇（pva）和海藻酸钠（sa）作为基底原料，依次将生物炭（bc）和二氧化硅加入到无氨去离子水中，用电磁加热炉搅拌加热，将其制备成溶液作为固定化载体pva-sa-bc；

14、2）制备菌悬液：将一株异养硝化好氧反硝化菌，培养于无机盐液体培养基中20-30小时离心重悬；

15、3）制备载体包埋复合体：选取生长处于对数生长期的异养硝化-好氧反硝化菌悬液，利用pbs溶液调节菌悬液od600为0.2-2.0，将灭菌冷却到室温后的固定化载体pva-sa-bc与异养硝化-好氧反硝化菌菌悬液按体积比(10-30):1混合充分搅拌；

16、4）固定活化交联-包埋复合体：将得到的固定化微生物的载体包埋复合体充分混合，用饱和硼酸和氯化钙对载体包埋复合体进行交联活化，得到经交联活化后的交联-包埋化的微生物载体复合体。

17、所述的一类异养硝化-好氧反硝化微生物固定化方法，所述固定化的异养硝化-好氧反硝化菌为异养硝化-好氧反硝化菌qd-21（ paracoccus sp.qd-21），于2022年11月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（cctcc），其地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，菌株保藏编号为cctcc no：m20221801，该异养硝化-好氧反硝化菌qd-21（ paracoccus sp.qd-21）其形态及生理生化特征包括：

18、1)革兰氏阴性菌；

19、2)菌体形态显微镜镜检为短杆状菌；

20、3)在培养基上，菌落形态为中间隆起的乳白色光滑圆形，其菌落边缘不规则。

21、所述的一类异养硝化-好氧反硝化微生物固定化方法，所述经固定化的异养硝化-好氧反硝化菌qd-21菌的样品扫描检测的方法，包括以下步骤：将经固定化的异养硝化-好氧反硝化菌qd-21样品用去离子水洗涤三遍后，分别用30%、50%、70%和90%的乙醇脱水处理后，放置于预冷好的-40℃真空冷冻干燥机中干燥20-24 h后形成冻干，用导电胶带将样品黏在样品台上，放在真空镀膜机内，将金喷镀到样品表面后取出样品，样品制备完毕再通过扫描电镜观察载体pva-sa-bc固定菌qd-21的固定化微生物的载体包埋复合体结构。

22、所述的一类异养硝化-好氧反硝化微生物固定化方法，所述的无机盐液体培养基:c4h4na2o4 3.375 g/l、nh4cl 0.382 g/l、k2hpo4 0.5 g/l、kh2po4 1 g/l、mgso4·7h2o 0.1g/l、微量元素溶液2 ml、蒸馏水定容至l l，ph 6.0-8.0；所述pbs缓冲液其ph为7-7.8。

23、所述的一类异养硝化-好氧反硝化微生物固定化方法，所述步骤3）中使用pbs缓冲液重悬菌液，其浓度od600为0.2-2.0，灭菌冷却后的固定化载体温度为20-30℃；步骤4）中加入的饱和硼酸和氯化钙溶液浓度(v/v）分别为2-3%和1-3%，交联温度为10-30℃，交联时间为6-12 h。

24、本发明显著效果是：

25、本发明所述微生物固定化方法简便，制备条件要求低，设备简单，能耗低，制备过程中不会产生毒性污染物，能保障环境和工作人员的安全，还适用于规模化生产，能实现大规模化制备；本发明制备的固定化微生物的成本较低，且质量稳定性高。制备过程条件温和，可以保持固定化菌体生物学活性，与传统的微生物固定方法相比，本发明通过添加不同载体材料，使菌体更加稳定，同时增加了传质效率，具有成型良好、稳定性高、强度大及抗外界环境干扰能力小的优点；本发明获得的异养硝化好氧反硝化菌固定化载体在同一个反应器内可以同时进行硝化和反硝化，克服传统工艺的缺点，降低污水处理过程中的基建和运行费用，拥有较好的应用前景。

技术实现思路