一种利用核酸结合特征小肽鉴别牛源和植物源蛋白的方法与流程

本发明属于食品检测，具体涉及一种利用核酸结合特征小肽鉴别牛源和植物源蛋白的方法。

背景技术：

1、随着生活水平的不断提升，人们对饮食健康有了更高的要求。食品中的蛋白质可以给人们提供丰富的营养元素，但是它作为食物中的过敏原会引发各种过敏反应，从而危及人类健康。

2、羊乳中含有丰富的蛋白质、脂肪、糖类、维生素和矿物质，其矿物质、维生素以及其他微量元素明显高于牛乳，例如钙、磷、维生素a和维生素b，另外还有较高含量的免疫球蛋白。羊乳中蛋白含量高于牛乳且不含有过敏性蛋白,蛋白质凝结块软且小，颗粒大小均匀，有利于人体消化吸收，尤其是对老人与婴幼儿。

3、目前，市场上羊乳产品种类越来越多,由以前单一的鲜羊奶发展到羊奶粉制品、液态羊奶制品、果味羊奶、羊奶酪、羊奶片及化妆品羊奶脂等。全球对羊乳及羊乳制品的消费量不断增加，但羊乳产量低，产量随季节性波动大，其价格也高，一般是牛乳的两倍以上。

4、真蛋白掺假物其本质是真蛋白，检测难度相对较大。无论是动物源蛋白还是植物源蛋白，基本的理化性质类似，如都由氨基酸组成，近似恒定的含氮量，有茚三酮、双缩脲、米伦等反应特性，因此，常规的实验方法难以区别乳源蛋白和非乳源蛋白。同时由于常见乳品成分及形态的相似性大，想要鉴别不同的乳源蛋白更是难上加难。

5、目前，常见的乳品中物种鉴定的检测技术有基于乳中高含量的蛋白质的方法，如免疫学和电泳的检测技术，免疫学灵敏度较高但易发生假阳性且抗体保存性不足，免疫学技术主要适用于动物蛋白的鉴别，目前尚未发现在植物蛋白鉴别中的应用。电泳分为聚丙烯酰氨凝胶电泳(page)、毛细管电泳(ce)和双向电泳，在欧盟电泳是一种广泛的有效的牛乳检测手段，目前已有不少文献报道了电泳技术在动植物蛋白鉴定中的应用。但是，基于蛋白质结构的方法不适于复杂母体来源的食品，蛋白质经过这些加工处理可能改变了其结构和稳定性，从而破坏物种特有的蛋白质高级结构或抗原决定部位，从而使得检测方法灵敏度降低。利用掺入外源蛋白质后给乳品带来的差异性，如外表、风味、质构的感官分析法近年来也悄然兴起，但这些差异性易随加工变化而损失严重。常用技术包括液相(hplc)、气相(gc)色谱检测方法和红外(ir)、近红外(nir)及核磁共振技术(nmr)等光谱检测方法，其中液相和气相费时费力、需要复杂的样品前处理，光谱技术几乎无需对样品预处理且其适合在线过程控制，但光谱需要建立复杂的模型，掌握和普及程度不足且仪器昂贵。

6、基于上述这些原因，以核酸为基础的分析法显示了其优势，乳中外源蛋白质的掺入会引入该外源有机体的种属特异性遗传物质dna，核酸能够耐高温，检测时是基于其特定的片段，dna的断裂对检测影响不大，可通过检测种属特异性dna片段来间接检测外源蛋白。因此，基于核酸检测的pcr技术(包括实时荧光定量pcr)、分子杂交以及基因测序等是进行乳制品中物种判别的最佳方法。相关研究证明pcr技术能高效准确地鉴别乳品中动植物来源，目标基因的最低检测限可达体积分数0.1％。然而pcr技术也不可避免地存在一些问题，如定量性能较差，存在假阳性，pcr效率高度依赖于dna提取质量等。因此仍需不断探索和优化pcr技术在乳制品中物种判别中应用。

7、基于质谱技术的蛋白组学研究对蛋白的准确定性鉴定和溯源提供了良好的平台。蛋白组学对蛋白的鉴定是根据其特有的一级结构信息进行定性的，正如核酸一样，不同来源蛋白的氨基酸组成顺序存在遗传上的差异，这种差异由物种的亲缘关系所决定。根据高分辨率质谱对蛋白的测序结果，与数据库已知的序列比较，即可确定该蛋白的来源，目前已有研究完成了部分动植物蛋白的质谱图谱数据库。蛋白的一级结构相对比较稳定，高温、干燥等加工处理对其影响较小。因此利用质谱mrm技术结合已知的蛋白图谱数据库，使同时实现乳品中多种蛋白准确、灵敏、高通量的定性定量和溯源技成为可能。质谱技术在乳品中物种鉴别的应用很大程度上取决于图谱库的丰富程度，且样品前处理相对比较复杂，因此质谱技术更适合作为确认技术应用于乳品物种鉴定。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种利用核酸结合特征小肽鉴别牛源和植物源蛋白的方法。

2、本发明提供的技术方案为：

3、1)收集羊乳制品(液体羊乳、羊乳粉等)、以及牛乳、植物源蛋白(大豆源、花生源)；

4、2)以羊乳制品为品探索合适的dna提取方法，主要考虑羊乳制品脂肪含量较高而且大部分为深加工产品目标基因含量较少的特点进行dna提取过程的优化，主要考察两到三种不同提取方式或提取试剂，以dna纯度、dna含量及pcr反应的ct值为考察目标，选定合适的dna提取程序；

5、3)选取特异性强的牛源及羊源、大豆源、花生源的引物和荧光探针，制备不同质量浓度dna溶液，研究不同质量浓度dna对应ct值，摸索dna质量浓度与ct值得线性关系，形成相关的标准曲线，探索方法的准确度、回收率、精密度等参数；

6、4)收集牛源及羊源、大豆源、花生源四种蛋白，对四种蛋白进行一级结构测序分析，确定特征肽段，作为该类来源蛋白的标识物。探讨合适的酶解体系、肽段提取、回收及净化的实验条件。对回收的特征肽段进行测序，以及糖基化、甲基化等修饰分析，验证是否与预期片段相符，并分析该片段对蛋白的标识情况；

7、5)研究牛源及羊源、大豆源、花生源四种蛋白的特征肽段标识物在液相色谱的分离度、质谱检测器的灵敏度、肽段在esi离子源电离下的电荷情况及准确质荷比、肽段碎片离子分布与碰撞能量变化的规律等，确定合适的色谱分离条件。以羊乳制品为测试样品探索质谱法合适的前处理方法，研究样品中蛋白分离提取、断裂、肽的回收等的条件，结合数据库中的质谱图谱，构建监测乳品中乳蛋白来源的lc-ms/ms定量方法，讨论方法的准确度、回收率、精密度等参数；

8、6)对100批次风险监测羊乳样品进行蛋白来源分析，以实时荧光pcr方法作为初筛技术，初步确定乳品蛋白掺假情况，再用lc-ms/ms方法进行进一步定量确认；

9、7)方法的验证、总结。

10、所述的前处理方法为实时荧光pcr前处理，分固态乳和液态乳进行，固态乳直接取样品2g至离心管，加入10ml pbs后涡旋数秒混匀；5 000×g 4℃离心10min后，弃上清及上层脂肪层，将离心产物中加入1ml pbs后涡旋数秒混匀；13 000×g 4℃离心5min，弃上清及上层脂肪层，留下沉淀；液态乳取10ml液态乳制品样品，5 000×g 4℃离心10min后，弃上清及上层脂肪层，将离心产物中加入1ml pbs后涡旋数秒混匀；13 000×g 4℃离心5min，弃上清及上层脂肪层，留下沉淀。

11、所述的液质联用前处理方法为：称取2g(精确到0.01g)乳粉样品，加入20ml提取溶液(50mm碳酸氢铵)，涡旋摇匀，于-20℃冰箱冷冻10min后，以10 000r/min高速离心30min两次，除去上层脂质，即得到脱脂奶；对于液态样品，摇匀后取20ml样品，于-20℃冰箱冷冻10min后，以10 000r/min高速离心30min两次，除去上层脂质，即得到脱脂奶。酶解：取2ml脱脂奶，加入20μl dtt溶液(0.5m，溶剂为50mm碳酸氢铵)，涡旋(混合溶液中dtt的浓度为5mm)，56℃震荡反应1h；反应时温度不能高于60℃，避免赖氨酸与蛋白n-末端发生氨甲酰化。放置室温后，加入iaa溶液(1m，溶剂为50mm碳酸氢铵)20μl，涡旋混匀(溶液中iaa的浓度为10mm)，暗处反应30min；加入iaa浓度是dtt的2倍，iaa见光分解，且分解物会对蛋白产生不良影响。取出，加入dtt溶液(0.5m)20μl(最终浓度为5mm)，暗处反应15min。将上述反应液用50mm碳酸氢铵稀释5倍后，然后按质量比1:20(胰蛋白酶:蛋白)的比例加入胰蛋白酶，37℃进行酶解反应16h。除盐(hlb小柱净化)：酶解后得到的肽段溶液，加入200μl 0.1％三氟乙酸(trifluoroacetic acid，tfa)终止酶解反应后，进行小柱除盐。用3～5ml乙腈清洗柱子一次；用3ml 0.1％tfa溶液平衡柱子一次；将肽段溶液加入到柱子内，使其缓慢滴下，控制在一滴/2s的速度；用3ml 0.1％tfa溶液洗一次。先用1.5ml50％acn/0.1％tfa溶液洗脱一次，然后再用2ml 80％acn/0.1％tfa溶液洗脱一次。氮吹后定容到1ml(用初始流动相比例溶解)，10000rpm离心5min取上清，待分析。

12、所述的实时荧光pcr反应体系，反应体系(25μl)如下：2×taqman fast qpcrmaster mix：12.5μl、上下引物各1μl(10μmol/l)、探针1μl(10μmol/l)、样品dna：1μl、无菌双蒸水：8.5μl，同时做阴性和阳性对照反应体系，即分别用1μl无菌双蒸水和1μl阳性dna替代1μl样品dna。牛源性成分反应条件如下：95℃10s，循环反应40次(95℃5s，60℃30s)。每循环退火时收集荧光信号。植物源性成分反应条件如下：95℃3min，循环反应40次(95℃15s，58℃1min)。每循环退火时收集荧光信号。

13、所述的特征肽段筛选q-tof，条件为色谱条件：色谱柱(beh300 c18，1.7μm，2.1*100mm)，流动相及流速(0.3ml/min)；进样量：3μl；柱温：40℃。

14、质谱条件：da range 50-2000，collision energey：low energy 6v，ramp highenergy：20-45v。将经仪器筛选得到特征肽段在uniprot蛋白数据库上进行blast分析,排除非特异性肽段,保留特征肽段,进一步验证其特异性。采用三重四级杆仪器测试，其条件为：1)色谱条件(色谱柱：beh300 c18，1.7μm，2.1*100mm；流动相及流速：0.3ml/min，a水(0.1％fa)，b乙腈(0.1％fa)；进样量：2μl；柱温：40℃)；2)质谱条件为扫描方式：多反应监测mrm；毛细管电压：3.5kv；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂流量：650l/h，源温度：110℃。

15、本发明采用荧光pcr方法，结合液相色谱-串联质谱及图谱数据库技术，建立准确、快捷、高通量的检测体系，鉴别羊乳中蛋白的来源及确认各蛋白组分的含量，为羊乳制品质量安全监督提供技术支持。目前针对食品中物种鉴别的研究主要是基于pcr技术，建立的方法一般都是通用型的，尤其是前处理过程对乳制品适用性不高，而且不满足定量检测的要求，本发明在原有的pcr技术上，针对乳制品样品特性优化了pcr过程，提高了方法的适用性。同时开发了以特征肽为标记物的液相色谱-串联质谱法，解决了无法定量的问题。