一种哈茨木霉源天然产物及制备方法和应用

本发明属于木霉次级代谢物领域，更具体地，涉及一种哈茨木霉源天然产物及制备方法和应用。

背景技术：

1、木霉(trichoderma spp.)作为一类重要的生防因子，对多种植物致病性真菌如黄瓜尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum cucumis)、水稻白叶枯病菌(xanthomonas oryzaepv.oryzae)、灰霉病菌(botrytis cinerea)、小麦禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)等都具有明显的抑制作用，并且可以提高植物的抗病性。据了解，木霉菌主要通过竞争、抗生、拮抗等方面的作用对病原菌进行抑制，其中抗生作用在近几年得到了许多研究者的关注。在木霉生长代谢的过程中，会产生一系列的次级代谢产物如多肽类、萜类、木霉菌素、甾体类、生物碱类和聚酮类等，这些产物中含有大量抗生性物质。

2、从绿色木霉ltr-2的次级代谢产物中经分离纯化得到的吡喃酮类物质5,6-二氢-6-戊基-2h-吡喃-2-酮对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、大丽轮枝菌等11种植物病原菌都具有一定的抑制作用。6pp是木霉分泌的一种具有椰子香气的常见活性代谢物，对马铃薯炭疽病菌(macrophomina phaseolina)、立枯丝核菌(rhizoctonia solani)、白绢病菌(sclerotiumrolfsii)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、辣椒疫霉(phytophthora capsica)、黄瓜疫霉(phytophthora melonis)等病原菌的菌丝生长具有良好的抑制作用。

3、木霉的次级代谢产物不仅可以拮抗植物病原菌，还可以诱导并提高植物抗病性并促进植物生长。

4、对于拮抗植物病原菌方面：elhasan等人发现6-pap能够控制玉米体内串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)引起的幼苗枯萎病，并提高玉米植株中的抗性酶pod、ppo和β-1,3-葡聚糖酶的活性，诱导玉米植株的防御反应。marra等人发现哈茨酸(harzianic acid，ha)、6-pp(6-pentyl-a-pyrone)与木霉活菌组联合使用能显著促进植物生长，增加植物体内矿物质。luo等从拟康氏木霉(t.pseudokoningii)分离得trichokonins，这是一种抗菌肽，烟草在烟草花叶病毒(tmv)的胁迫下，它可以提高烟草中的抗氧化酶pal和pod的活性，上调多种植物防御基因的表达，提高烟草的抗病性。malmierca等发现苇状木霉(t.arundinaceum)分泌的trichodiene(td)可以诱导番茄水杨酸(sa)防御基因的表达，并降低侧根的发育。pascale等人发现哈茨酸(harzianic acid，ha)和6-pp(6-pentyl-a-pyrone)可以抑制葡萄白粉病的发病率，并且6-pp可以提高葡萄中的多酚总含量和抗氧化活性以及葡萄产量和品质。

5、但目前，研究木霉次级代谢物对植物的抗病诱导还较少。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种哈茨木霉源天然产物和制备方法及应用。本发明从哈茨木霉次级代谢产物中分离提纯得到哈茨木霉源天然产物lu-11，可应用于抑制小麦赤霉病禾谷镰刀菌ph-1的生长，诱导并提高小麦的抗病性，为生物农药的开发提供了一定的理论依据。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种哈茨木霉源天然产物，该天然产物具有式i所示结构：

3、

4、本发明第二方面提供了一种哈茨木霉源天然产物的制备方法，该制备方法包括将哈茨木霉依次进行大米发酵培养和萃取分离纯化，得到权利要求1所述的哈茨木霉源天然产物。

5、根据本发明，优选地，所述大米发酵培养的温度为25-30℃，时间为30-40d。

6、根据本发明，优选地，所述萃取分离纯化包括依次进行的乙酸乙酯萃取、正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析和液相色谱分离。

7、根据本发明，优选地，所述乙酸乙酯萃取进行的次数为3-4次。

8、根据本发明，优选地，所述正相硅胶柱层析采用的减压梯度洗脱体系为石油醚-二氯甲烷-甲醇体系。

9、根据本发明，优选地，所述反相硅胶柱层析采用的减压梯度洗脱体系为甲醇-水体系。

10、在本发明中，作为优选方案，哈茨木霉源天然产物即哈茨木霉源lu-11的制备方法包括如下步骤：

11、1)将哈茨木霉的孢子液依次进行大米发酵培养，获得发酵物；

12、2)将发酵物与乙酸乙酯混合并进行超声处理3-4次，然后将含有发酵物的乙酸乙酯进行45℃减压旋蒸处理，得到乙酸乙酯总提取物；

13、3)将乙酸乙酯总提取物进行正相硅胶柱层析，得到含有哈茨木霉源lu-11的正相柱层析组分；

14、4)将含有哈茨木霉源lu-11的正相柱层析组分进行反相硅胶柱层析，得到含有哈茨木霉源lu-11的反相柱层析组分；

15、5)将含有哈茨木霉源lu-11的反相柱层析组分进行液相色谱分离和液相色谱检测分析，在馏分中检测到哈茨木霉源lu-11。

16、在本发明中，哈茨木霉的孢子液的制备方法包括：在含有哈茨木霉t-aloe菌落的pda平板上，用9mm打孔器截取菌饼，接入含有150mlpdb培养基的锥形瓶中，将锥形瓶放入25℃、180r/min的恒温摇床中培养4d。将培养4d的哈茨木霉t-aloe发酵液，用4层无菌纱布过滤，吸取1ml已过滤的孢子液，放置在光学显微镜下观察孢子数并记录，最后将孢子液放置4℃冰箱备用。

17、本发明第三方面提供了所述的哈茨木霉源天然产物在以下方面的应用：

18、1)抑制小麦赤霉病病原禾谷镰刀菌的生长；

19、2)诱导植物抗病性；

20、3)防治植物幼苗赤霉病。

21、根据本发明，优选地，所述哈茨木霉源天然产物在抑制小麦赤霉病禾谷镰刀菌的生长的应用采用溶液形式进行，哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为5-100mg/l。在本发明中，作为优选方案，应用于抑制小麦赤霉病禾谷镰刀菌的生长的哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为5、10、20、40、60、80和100mg/l。

22、根据本发明，优选地，哈茨木霉源天然产物诱导植物抗病性的方式包括提高植物抗氧化酶、降低植物细胞膜脂过氧化和降低植物细胞损伤；

23、根据本发明，优选地，所述哈茨木霉源天然产物在诱导植物抗病性的应用采用溶液形式进行，哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为0.1-100mg/l。在本发明中，作为优选方案，应用于诱导植物抗病性的哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为0.1、1、10和100mg/l。

24、根据本发明，优选地，所述哈茨木霉源天然产物在防治植物幼苗赤霉病的应用采用溶液形式进行，哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为0.1-100mg/l。在本发明中，作为优选方案，应用于防治植物幼苗赤霉病的哈茨木霉源天然产物溶液的浓度为0.1、1、10和100mg/l。

25、本发明的技术方案的有益效果如下：

26、本发明从哈茨木霉次级代谢产物中分离提纯得到的哈茨木霉源天然产物lu-11是一种新发现的哈茨木霉源新天然产物，可应用于抑制小麦赤霉病病原禾谷镰刀菌ph-1的生长，诱导并提高小麦的抗病性，为生物农药的开发提供了一定的理论依据。

27、本发明的哈茨木霉源天然产物可实现大规模生产，而且天然安全。

28、本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。