转酯酶及其用途、维生素A棕榈酸酯的制备方法与流程

本发明涉及功能酶筛选，具体涉及一种来源于荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)的转酯酶、其编码核酸分子、重组载体、重组细胞、该转酯酶的制备方法和在制备维生素a棕榈酸酯中的用途，以及一种维生素a棕榈酸酯的制备方法。

背景技术：

1、维生素a及其衍生物产品由于其性质不稳定，因此多以酯的形式存在，常见形式有维生素a醋酸酯和维生素a棕榈酸酯。与维生素a醋酸酯相比，维生素a棕榈酸酯的产品附加值更高且性质更加稳定。

2、目前，维生素a棕榈酸酯的合成工艺主要包括化学法和酶法。其中，酶法是以维生素a醋酸酯为原料，在酶的催化作用下与棕榈酸或棕榈酸酯反应生成维生素a棕榈酸酯。中国专利cn201110110428.8中，以酵母展示脂肪酶为催化剂制备维生素a棕榈酸酯时，转化率仅为90％，表明该酶的转酯活性偏低。

3、因此，有必要开发高酶活的转酯酶。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种来源于荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)的转酯酶，旨在解决现有的转酯酶在催化生产维生素a棕榈酸酯时存在的转化率不高的问题。

2、为了实现上述发明目的，本发明从荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)中获得转酯酶，并进一步对其进行突变处理，使其在酶活性、转化率方面均显著改善。

3、具体地，第一方面，本发明提供了一种转酯酶，其为：

4、i)氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白质；或者

5、ii)将seq id no:1所示的氨基酸序列经过一个、两个或更多个氨基酸残基经取代、缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

6、本发明提供的上述转酯酶中，i)所述蛋白质为母体转酯酶，ii)所述的蛋白质是i)所述蛋白质的突变体(转酯酶突变体)，其与母体转酯酶相比，在催化活力和转化率方面均有显著提升。

7、在一些实施方案中，ii)所述的蛋白质(转酯酶突变体)的氨基酸序列如seq idno:2所示。此时，转酯酶突变体在母体转酯酶的氨基酸序列基础上，第157位的d突变为y，第264位的s突变为t，第306位的n突变为k、第393位的k突变为q。

8、本发明提供的转酯酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，例如使用重组技术从原核宿主(如，大肠杆菌)或真核宿主(如酵母、高等植物)中表达获得。

9、在一些实施方案中，所述转酯酶是通过将含有其编码基因的重组载体转化至大肠杆菌表达宿主(例如e.coli bl21(de3))中得到重组工程菌，然后将该重组工程菌进行诱导表达获得。

10、第二方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码所述转酯酶。

11、在一些实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:3或seq id no:4所示。

12、本发明提供的核酸分子可以通过pcr扩增或人工合成的方法获得。

13、第三方面，一种重组载体，其包含本发明所述的核酸分子。

14、在一些实施方案中，所述重组载体为pet-m86350或pet-δm86350-mut，分别是将编码所述转酯酶的核酸分子替换pet-28a(+)的bamhi和ecori酶切位点间序列，其余序列保持不变得到。

15、第四方面，本发明提供了一种重组细胞，其包含本发明所述的重组载体。

16、在一些实施方案中，所述重组细胞诱导产生本发明提供的来源于荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)的转酯酶。

17、在一些实施方案中，所述重组细胞的构建方法包括：

18、将所述重组载体转化至宿主细胞中，经诱导培养，得到来源于荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)的转酯酶。

19、进一步地，所述重组载体为上述任一所述的重组载体，所述宿主细胞为原核生物生物细胞或真核生物细胞，例如大肠杆菌、酵母等，优选大肠杆菌e.coli bl21(de3)。

20、第五方面，本发明提供了一种转酯酶的制备方法，包括：

21、对本发明提供的所述重组细胞进行诱导培养，得到培养物；

22、从所述培养物中分离本发明提供的所述转酯酶。

23、其中，对重组细胞进行诱导培养的方法、从培养物中分离转酯酶的方法均为本领域的常规方法。

24、在所述诱导培养中所使用的培养基为本领域可以使重组基因工程菌生长并表达的常规培养基，优选lb培养基。

25、在所述诱导培养中，对于培养方法和培养条件没有特殊要求，保证重组基因工程菌株正常生长即可，优选在20℃条件下诱导表达所述转酯酶。

26、在一些实施方案中，诱导培养所用的诱导剂为iptg。

27、第六方面，本发明提供了所述转酯酶、所述核酸分子、所述突变体、所述重组载体、所述重组细胞和/或所述制备方法制备得到的转酯酶在制备维生素a棕榈酸酯中的用途。具体地，利用转酯酶的酯交换活性，以维生素a醋酸酯和棕榈酸为底物，合成维生素a棕榈酸酯。

28、第七方面，本发明提供了一种维生素a棕榈酸酯的制备方法，包括：

29、以本发明所述转酯酶、所述重组细胞和/或所述制备方法制备得到的转酯酶作为催化剂，催化维生素a醋酸酯和棕榈酸进行酯交换反应，得到维生素a棕榈酸酯。

30、在一些实施方案中，所述维生素a棕榈酸酯的效价大于180万iu/g，过氧化值小于1meq/kg。

31、在一些实施方案中，所述酯交换反应在离子液体中进行。通过采用离子液体作为溶剂，一方面没有饱和蒸气压，在反应时不会蒸发，同时可以保证酶的活性；另一方面离子液体具有可重复利用、使用量少、产生的三废量少的优点，尽可能避免对环境产生污染。

32、在一些优选实施方案中，所述离子液体选自[c2mim][bf4]、[bmim][bf4]和[omim][pf6]中的至少一种。

33、在一些实施方案中，所述酯交换反应的温度为30-45℃，例如31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃，从而在保证酶活的基础上，提高反应转化率。

34、在一些优选实施方案中，所述酯交换反应的温度为33-38℃。

35、在一些实施方案中，所述酯交换反应的时间为6-12h，例如6h、7h、8h、9h、10h、11h或12h，从而在保证酶活的基础上，提高反应转化率。

36、在一些优选实施方案中，所述酯交换反应的时间为7-9h。

37、在一些实施方案中，所述维生素a醋酸酯与所述棕榈酸的摩尔比为1:(1-1.5)，例如1:1、1:1.15、1:1.2、1:1.25、1:1.3、1:1.35、1:1.4、1:1.45或1:1.5，以提高反应转化率。

38、在一些优选实施方案中，所述维生素a醋酸酯与所述棕榈酸的摩尔比为1:(1-1.15)。

39、在一些实施方案中，所述维生素a醋酸酯与所述离子液体的质量体积比(即每克维生素a醋酸酯对应每毫升离子液体)为1:(6-12)，例如1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11或1:12，以提高反应转化率。

40、在一些优选实施方案中，所述维生素a醋酸酯与所述离子液体的质量体积比为1:(8-10)。

41、在一些优选实施方案中，所述维生素a醋酸酯与所述催化剂的质量比为1:(0.1-0.3)，优选1:(0.12-0.2)，例如1:0.1、1:0.12、1:0.15、1:0.2、1:0.25或1:0.3。更优选地，以本发明所述重组细胞(例如，重组湿细胞)作为催化剂催化酯交换反应。

42、在一些实施方案中，所述酯交换反应后，在负压条件下除去反应生成的醋酸，过滤得到反应液，所述反应液经分离纯化得到维生素a棕榈酸酯。其中，通过在负压条件下去除醋酸，可进一步提高反应转化率，进而保证产品质量。优选地，所述负压条件是指体系绝对压力为1-3kpa，例如1kpa、1.5kpa、2kpa、2.5kpa或3kpa，更优选1.5-2.5kpa。其中，对于分离纯化，可采用本领域已知的方法进行，优选地，所述分离纯化是采用溶剂对所述反应液进行萃取后，经冷却结晶、过滤，得到维生素a棕榈酸酯；并且，采用溶剂对所述反应液进行萃取还可实现对离子液体的回收再利用。其中，所述溶剂选自正己烷、正庚烷和石油醚中的至少一种，优选正己烷；所述反应液与所述溶剂的体积比为1:(1-2)，例如1:1、1:1.4、1:1.5、1:1.7或1:2，优选1:(1.4-1.7)；所述冷却结晶的温度为-5℃至-10℃，例如-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃或-10℃，优选-7至-9℃。

43、本发明首次提供了一种荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)的转酯酶。本发明提供的转酯酶具有优于商品酶的高转酯活性，不仅可以提高反应转化率，高效催化维生素a棕榈酸酯合成，得到效价大于180万iu/g且过氧化值小于1meq/kg的高品质维生素a棕榈酸酯，而且可以降低生产成本。此外，本发明采用一步酶法制备维生素a棕榈酸酯，操作简单方便，减少了维生素a棕榈酸酯在中间过程被破坏的可能。