一种基于劣势PAM一锅法检测单增李斯特菌的方法及试剂盒与流程

本发明涉及一种快速检测技术，特别是涉及一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的方法及试剂盒。

背景技术：

1、单核细胞增生李斯特氏菌(listeria monocytogenes)，简称单增李斯特菌，兼性厌氧，革兰氏阳性菌，广泛存在于自然界中。单增李斯特氏菌导致的细菌性食物中毒主要是通过食用受污染的食物，例如乳制品，即食肉和海鲜以及蔬菜和水果而发生的，且污染主要发生在加工过程中。单增李斯特菌感染会导致胃肠道疾病，对于免疫功能低下的患者会导致脑部和血液感染，或导致孕妇出现胎儿并发症。单增李斯特菌是一种会形成生物膜的嗜冷菌，对大多数消毒剂具有抵抗力。因此，在危害前建立快速、灵敏、低成本的即时检测（point of care testing，poct）方案已成为迫切需求。

2、pcr虽然是最常用的核酸扩增方法，但通常需要复杂的热循环器和多种温度控制程序，而目前基于crispr的检测方法等温扩增测定，例如重组酶聚合酶扩增（rpa）和环介导等温扩增（lamp），提供了快速和低成本的替代方法。但是，这些方法除了rna提取步骤外，还需要两步过程（扩增目标序列，然后进行crispr检测），多个液体处理步骤增加了操作时间和交叉污染的风险，不符合poct检测的趋势。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的方法及试剂盒，用于解决现有技术的检测方法处理步骤多，操作时间长，存在交叉污染的风险。

2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包括crispr体系、rpa扩增体系和环状近端报告探针；其中，所述crispr体系包括ascas 12a rnp和包含劣势pam序列的crrna；所述rpa扩增体系包括rpa颗粒、聚合酶和扩增引物。

4、减少rnp和靶dna之间的结合的方法是设计crrna以靶向次优pam。原型间隔子邻近基序(protospaceradjacentmotif，pam)是紧跟在crispr细菌适应性免疫系统中cas核酸酶靶向的序列的2-8碱基对dna序列。pam是重要的靶向组分。每个cas核酸酶具有一个或多个经典pam序列，以及一些非经典序列。非经典pam（劣势pam）不是最优的，并且可能导致结合和切割的效率更低。

5、本发明通过使用劣势pam序列设计的crrna，使cas12a/crrnarnp以较低的亲和力结合底物，降低crispr体系初始切割能力，从而较慢地进行crispr切割反应，使反应进程偏向等温扩增，可以快速依靠预扩增产生远多于经典crrna的扩增子，实现扩增和crispr-cas12a切割同步进行，缩短反应时间，减少操作步骤。

6、所述劣势pam序列包括单碱基差异pam：vttv、tvtv、ttvv；多碱基差异pam：vvtv、vtvv、tvvv；和特殊碱基差异pam：tttt、rrrn、vvvn；其中，r表示a+g、y表示c+t、v表示a+c+g、n表示a+c+g+t。

7、因为cas12a酶与crrna作用时，结合靶dna的主要作用的结构域就是pam序列上的第二个核苷酸；因此，将pam序列的第二个核苷酸从嘧啶变为嘌呤可能会显著削弱cas12a的活性，但对胸腺嘧啶替换为胞嘧啶有更高的耐受性。因此，在单碱基差异pam中，性能更佳的是vttv和ttvv。

8、多碱基差异是将标准pam（tttv）替换为vvtv、vtvv、tvvv。多碱基差异多数不存在crispr反式切割活性，vvtv和vtvv在一锅反应中都显示较慢的荧光动力学和荧光强度。仅tvvv的包含的多碱基差异中，胞嘧啶替代胸腺嘧啶的tccv在一锅反应中具有明显的优势，原理同tctv，产生了与单碱基差异的劣势crrna相近的荧光信号。

9、特殊碱基差异包括三类碱基差异，rrrn、vvvn以及四号位碱基差异的tttt。由于cas12a/crrna的pam可以耐受胸腺嘧啶到胞嘧啶的替换，pam序列为cccv的劣势crrna在一锅反应中也具有明显优势。

10、相较于单纯rpa扩增体系，crispr反式切割和rpa等温扩增存在相互竞争，通过监测一锅反应中扩增子的形成，在标准pam组中需要8~10min才能识别到扩增子，而在劣势pam组的onepot反应中，2min就观察到目标扩增子。此外，在每个时间点，单独使用劣势pam产生的扩增子数量远远大于使用标准pam的一锅反应。可见，cas12a/crrna rnp和底物结合后产生的反式切割活性可能会干扰rpa扩增子的产生。

11、于本发明的一实施例中，1x所述crispr体系包括20~30 mm hapes、3~8%蔗糖、2~3%普鲁兰糖、3~8%甘露醇、100~300nm ascas 12a rnp和100~200 nm 包含劣势pam序列的crrna。

12、优选的，1x所述crispr体系包括20 mm hapes、5%蔗糖、2.5%普鲁兰糖、5%甘露醇、200 nm ascas 12a rnp和200 nm crrna。为更好地保存，所述crispr体系的ph为 8.0。

13、所述crispr体系经过冻干处理，在配置好上述试剂后进行冻干时，首先在-80℃的冰箱中进行5min预冷，再用液氮进行速冻并冷冻干燥过夜，即得到crispr冻干粉，随取随用，在使用过程中省去了繁琐的添加。

14、本发明使用重组酶聚合酶扩增(rpa)进行等温扩增，rpa使用重组酶来帮助引物侵入双链dna，形成d环重组结构，这些结构通过链置换dna聚合酶启动扩增。rpa通常在约37℃~42℃下进行，并且与其他等温扩增的方法不同，rpa可以产生高达1kb的离散扩增子。

15、于本实施例中，所述扩增引物包括如seq id no .1所示的上游引物和如seq idno .2所示的下游引物。其中，所述上游引物和下游引物的加入量分别为0.4μm。

16、表1、rpa引物及探针序列

17、

18、注：划线部分为环结构域。

19、其中，所述rpa扩增体系经过冻干处理，得到rpa冻干粉，其冻干处理的过程与crispr体系冻干处理的过程相同。

20、在一锅反应中，所述crispr冻干粉和所述rpa冻干粉使用1xneb buffer2.1作为切割和扩增反应的缓冲液。neb buffer2.1中的镁离子可以激活crispr体系的反式切割能力，并且作为rpa扩增的缓冲液，提供所需离子。

21、于本发明的一实施例中，为了增强ascas 12a rnp的反式切割活性和降低背景荧光，本发明引入环状近端报告探针降低背景荧光，其保留了共同的茎序列（即 3gc+2at），但存在不同长度的环结构域。当 cas12a/crrna rnp 被激活时，能够非特异性地切割茎环探针上单链环部分，那么短的自我互补茎无法维持互补配对结构，从而导致荧光信号的快速增加。并且，本发明在短互补茎（3gc+2at）的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团，在crispr-cas12a 系统中具有更低的背景荧光和更高的反式切割活力，其反式切割的过程如图1所示。

22、进一步的，所述环状近端报告探针的环结构域的长度为5~30数量的嘧啶。优选的，该环状近端报告探针的环结构域为10t，其序列如seq id no .3所示。

23、本发明的第二方面，一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的方法，包括以下步骤：

24、s1、提取待测样本的核酸；

25、s2、将提前预制的crispr冻干粉、rpa冻干粉以及环状近端报告探针加入1×nebbuffer2.1中，然后加入步骤s1的核酸，37~42℃孵育20~30min；

26、s3、切割后的反应物通过肉眼或荧光读数器读取测试信号，并进行分析。

27、在步骤s1中，通过加热裂解法提取待测样本的核酸，所述加热裂解法包括以下步骤：将2ml样品重悬于200µl的tris-edta缓冲液中，加热裂解8min~10min，然后以12000×g的转速离心2min，取上清液作为底物，通过k5500超微分光光度计和nanodrops测定dna浓度和纯度。

28、在步骤s2中，将crispr冻干粉rpa冻干粉提前预制并装在扩增管中，加入1×nebbuffer2.1后，通过离心力（5000r/min，30s）将混合液体离心到底部，然后再加入核酸进行孵育。

29、在一锅反应中，所述环状近端报告探针的加入量为200~400nm，核酸的浓度为5~12nm。

30、如上所述，本发明的一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的方法及试剂盒，具有以下有益效果：

31、1、本发明通过使用劣势pam序列设计的crrna，使cas12a/crrnarnp以较低的亲和力结合底物，降低crispr体系初始切割能力，从而较慢地进行crispr切割反应，使反应进程偏向等温扩增，可以快速依靠预扩增产生远多于经典crrna的扩增子，实现扩增和crispr-cas12a切割同步进行，缩短反应时间，减少操作步骤。

32、2、本发明引入环状近端报告探针，其保留了共同的茎序列（即 3gc+2at），但存在不同长度的环结构域，当 cas12a/crrna rnp 被激活时，能够非特异性地切割茎环探针上单链环部分，那么短的自我互补茎无法维持互补配对结构，从而导致荧光信号的快速增加；并且，本发明在短互补茎（3gc+2at）的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有淬灭基团，在crispr-cas12a系统中具有更低的背景荧光和更高的反式切割活力。

33、3、本发明将crispr体系和rpa体系进行冻干处理分别得到冻干粉，随取随用，在使用过程中省去了繁琐的添加。