一种基于劣势PAM一锅法检测单增李斯特菌的方法及试剂盒与流程

文档序号:37125496发布日期:2024-02-22 21:36阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括crispr体系、rpa扩增体系和环状近端报告探针;其中,所述crispr体系包括ascas 12a rnp和包含劣势pam序列的crrna;所述rpa扩增体系包括rpa颗粒、聚合酶和扩增引物。

2.根据权利要求1所述的一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的试剂盒,其特征在于,所述劣势pam序列包括单碱基差异pam:vttv、tvtv、ttvv;多碱基差异pam:vvtv、vtvv、tvvv;和特殊碱基差异pam:tttt、rrrn、vvvn;其中,r表示a+g、y表示c+t、v表示a+c+g、n表示a+c+g+t。

3.根据权利要求1所述的一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的试剂盒,其特征在于,1x所述crispr体系包括20~30 mm hapes、3~8%蔗糖、2~3%普鲁兰糖、3~8%甘露醇、100~300nm ascas 12a rnp和100~200 nm 包含劣势pam序列的crrna。

4.根据权利要求1所述的一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的试剂盒,其特征在于,所述crispr体系和所述rpa体系分别经过冻干处理,得到crispr冻干粉和rpa冻干粉。

5.根据权利要求4所述的一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的试剂盒,其特征在于,所述crispr冻干粉和rpa冻干粉使用1xneb buffer 2.1作为切割和扩增反应的缓冲液。

6.根据权利要求1所述的一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的试剂盒,其特征在于,所述扩增引物包括如seq id no .1所示的上游引物和如seq id no .2所示的下游引物。

7.根据权利要求1所述的一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的试剂盒,其特征在于,所述环状近端报告探针具有“3gc+2at”的茎序列和不同长度的环结构域。

8.根据权利要求7所述的一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的试剂盒,其特征在于,所述环结构域为10t。

9.一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的方法,其特征在于,包括以下步骤:

10.根据权利要求9所述的一种基于劣势pam一锅法检测单增李斯特菌的方法,其特征在于,在一锅反应中,所述环状近端报告探针的加入量为200~400nm,核酸的浓度为5~12nm。


技术总结
本发明提供一种基于劣势PAM一锅法检测单增李斯特菌的方法及试剂盒,所述试剂盒包括CRISPR体系、RPA扩增体系和环状近端报告探针;其中,所述CRISPR体系包括AsCas 12a RNP和包含劣势PAM序列的crRNA;所述RPA扩增体系包括RPA颗粒、聚合酶和扩增引物。本发明通过使用劣势PAM序列设计的crRNA,使Cas12a/crRNARNP以较低的亲和力结合底物,降低CRISPR体系初始切割能力,从而较慢地进行CRISPR切割反应,使反应进程偏向等温扩增,可以快速依靠预扩增产生远多于经典crRNA的扩增子,实现扩增和CRISPR‑Cas12a切割同步进行,缩短反应时间,减少操作步骤;并且,本发明引入环状近端报告探针,降低背景荧光、提高检测灵敏度。

技术研发人员:肖理文,赵皖,王海宇,丁丽,谈婷
受保护的技术使用者:南京微测生物科技有限公司
技术研发日:
技术公布日:2024/2/21
当前第2页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1