细胞器荧光标记mRNA及其应用的制作方法

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种细胞器荧光标记mrna及其应用。

背景技术：

1、真核细胞通过在不同的区室中进行物质和能量代谢，以提高生命活动中生物化学反应的效率和精确性。细胞内区室化是真核细胞的特点之一，细胞中的不同亚细胞区室称为细胞器。对于细胞器进行标记之后，可以直观的观察到细胞器的形态和动态变化，从侧面反应出细胞的功能是否有异常；此外，还可以确认某些定位未知的蛋白的亚细胞定位，为其功能研究奠定基础，因此，细胞器标记技术的研究很有必要。

2、目前标记细胞器的方法主要有以下几种：通过细胞免疫荧光对细胞器的标志蛋白进行染色(主要用于固定细胞)；转染带有细胞器定位序列的荧光蛋白质粒；以及一些商业化的产品，比如化学分子mitotracker green，还有celllight荧光蛋白标记技术。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是现有技术中进行细胞器标记毒性大、淬灭速度快、标记效率低的缺陷，提供了一种细胞器荧光标记mrna及其应用。本发明的细胞器荧光标记mrna编码亚细胞结构信号肽与荧光蛋白形成的融合蛋白，可作为细胞器荧光标志物，细胞毒性小、光淬灭速度慢、标记的效率高，可以实现方便快捷的活细胞的多细胞器标记，以及标记常规质粒转染困难的原代细胞。

2、本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

3、本发明的第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括亚细胞定位信号肽和荧光蛋白；

4、所述亚细胞定位信号肽用于将所述荧光蛋白定位至细胞中的亚细胞结构。

5、本发明一些实施方案中，所述细胞为植物细胞或动物细胞。

6、本发明一些实施方案中，所述亚细胞结构选自细胞核、线粒体、内质网、高尔基体、核糖体、过氧化物酶体、细胞骨架、细胞质基质、内体、细胞外间隙和细胞膜。

7、本发明一些较佳实施方案中，所述亚细胞结构域选自细胞核、线粒体、内质网、过氧化物酶体、细胞骨架和细胞膜。

8、本发明一些实施方案中，所述荧光蛋白选自mturquoise2、mscarlet和egfp。

9、本发明一些实施方案中，所述亚细胞定位信号肽与所述荧光蛋白通过连接肽连接。

10、本发明一些较佳实施方案中，当所述亚细胞结构为细胞核时，所述亚细胞定位信号肽连接在所述荧光蛋白的c端。

11、本发明另一些较佳实施方案中，当所述亚细胞结构为线粒体时，所述亚细胞定位信号肽连接在所述荧光蛋白的n端。

12、本发明另一些较佳实施方案中，当所述亚细胞结构为内质网时，所述亚细胞定位信号肽连接在所述荧光蛋白的n端。

13、本发明另一些较佳实施方案中，当所述亚细胞结构为高尔基体时，所述亚细胞定位信号肽连接在所述荧光蛋白的n端。

14、本发明另一些较佳实施方案中，当所述亚细胞结构为过氧化物酶体时，所述亚细胞定位信号肽连接在所述荧光蛋白的c端。

15、本发明另一些较佳实施方案中，当所述亚细胞结构为细胞骨架时，所述亚细胞定位信号肽连接在所述荧光蛋白的n端。

16、本发明另一些较佳实施方案中，当所述亚细胞结构为细胞膜时，所述亚细胞定位信号肽连接在所述荧光蛋白的n端。

17、本发明一些具体实施方案中，当所述亚细胞结构为细胞核时，所述亚细胞定位信号肽包含如seq id no:29所示的氨基酸序列。

18、本发明另一些具体实施方案中，当所述亚细胞结构为线粒体时，所述亚细胞定位信号肽包含如seq id no:27所示的氨基酸序列。

19、本发明另一些具体实施方案中，当所述亚细胞结构为内质网时，所述亚细胞定位信号肽包含如seq id no:26所示的氨基酸序列。

20、本发明另一些具体实施方案中，当所述亚细胞结构为高尔基体时，所述亚细胞定位信号肽包含如seq id no:31所示的氨基酸序列。

21、本发明另一些具体实施方案中，当所述亚细胞结构为过氧化物酶体时，所述亚细胞定位信号肽包含如seq id no:25所示的氨基酸序列。

22、本发明另一些具体实施方案中，当所述亚细胞结构为细胞骨架时，所述亚细胞定位信号肽包含如seq id no:28所示的氨基酸序列。

23、本发明另一些具体实施方案中，当所述亚细胞结构为细胞膜时，所述亚细胞定位信号肽包含如seq id no:30所示的氨基酸序列。

24、本发明一些较佳实施方案中，所述连接肽包含gss或如seq id no:32所示的氨基酸序列。

25、本发明一些具体实施方案中，所述融合蛋白具有如seq id no:1～seq id no:21任一所示的氨基酸序列。

26、本发明的第二方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如第一方面所述的融合蛋白。

27、本发明一些实施方案中，所述多核苷酸为mrna或dna。

28、本发明一些具体实施方案中，编码所述亚细胞定位信号肽的多核苷酸的序列如seq id no:54～seq id no:60任一所示。

29、本发明一些具体实施方案中，编码所述融合蛋白的多核苷酸的序列如seq id no:33～seq id no:53任一所示。

30、本发明的第三方面一种递送系统，所述递送系统包括(1)如第一方面所述的融合蛋白，或者如第二方面所述的多核苷酸，以及(2)递送载体。

31、本发明中，所述递送载体为本领域已知的用于递送核苷酸载体。非病毒载体可为阳离子脂质体、聚合物纳米粒子、生物脂质体，例如去核红细胞或外泌体。本领域技术人员可通过本领域已知的方法使用上述递送载体进行融合蛋白或多核苷酸的递送。

32、本发明的第四方面提供一种细胞，所述细胞中包含如第一方面所述的融合蛋白，或者如第二方面所述的多核苷酸。

33、本发明的第五方面提供一种在细胞中进行亚细胞定位的方法，所述方法包括：

34、向细胞中引入如第一方面所述的融合蛋白，或者如第二方面所述的多核苷酸的步骤。

35、本发明一些实施方案中，所述引入通过如第三方面所述的递送系统实现。

36、本发明一些实施方案中，所述细胞为活细胞。

37、本发明一些实施方案中，所述方法还包括在引入后进行孵育的步骤。

38、本发明一些实施方案中，所述方法还包括在所述荧光蛋白的激发波长下进行显色的步骤。

39、本发明的第六方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如第一方面所述的融合蛋白，如第二方面所述的多核苷酸，或者如第三方面所述的递送系统。

40、本发明一些实施方案中，所述试剂盒还包含转染试剂。

41、本发明的第七方面提供一种如第一方面所述的融合蛋白，如第二方面所述的多核苷酸，如第三方面所述的递送系统，或者如第四方面所述的细胞在标记和/或定位细胞中细胞器中的应用。

42、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

43、本发明所用试剂和原料均市售可得。

44、本发明的积极进步效果在于：

45、本发明的细胞器荧光mrna可作为细胞器荧光标志物，相比于现有方法具有细胞毒性更小、光淬灭速度慢、标记的效率高等特点，在活细胞成像领域独具优势，可以实现方便快捷的多细胞器标记，以及标记常规质粒转染困难的原代细胞。