一种辅酶自足型底盘细胞在生物合成中的应用

本发明涉及生物；特别涉及一种nad激酶及其突变体，以及包含nad激酶及其突变体的辅酶自足型底盘细胞，以及在生物合成制备医药中间体中的应用。

背景技术：

1、在基因工程中，"底盘细胞"(host cells)通常指的是在基因工程实验中被用作载体的细胞。这些细胞被用来承载质粒或外源基因，通过基因重组的方法，使其能够表达并产生特定的蛋白质。底盘细胞可以被转化或修改，使其具备接受、复制和表达外源基因的能力。

2、在基因工程中，通常会将目标基因插入质粒载体或底盘细胞的基因组中，使其成为目标基因的宿主。底盘细胞会利用其自身的生物合成机制来产生被插入基因所编码的蛋白质。这种技术被广泛应用于生物制药、基因治疗、农业生物技术等领域，用来生产药物、生长因子、酶、激素、抗体等各种生物产品。

3、在基因工程研究中，选择合适的底盘细胞非常关键，因为不同的细胞类型对基因的表达和蛋白质产生可能有不同的影响。一些常用的底盘细胞包括大肠杆菌(escherichiacoli)、酵母菌(saccharomyces cerevisiae)、哺乳动物细胞(例如cho细胞、hek293细胞等)等。选择合适的底盘细胞是基因工程研究中的重要步骤，可以影响到生产效率和产物质量。

4、3-氨基-2-羟基苯乙酮，英文名为1-(3-amino-2-hydroxyphenyl)ethanone(简称3ahap)，是合成普仑司特的关键中间体。普仑司特(pranlukast)是一种口服支气管哮喘治疗药物，属于白三烯(cyslts)受体拮抗剂，能够有效抑制ltd4受体从而治疗哮喘。较于其他白三烯拮抗剂，普仑司特具有选择性抑制强、适用性广、副作用小等特点，拥有广阔的市场前景和重大研究价值。

5、熊去氧胆酸(udca)是一种内源性胆汁酸，已被证明可以溶解胆结石，在治疗胆囊和肝脏相关疾病方面比其他内源性胆汁酸表现出更好的疗效。迄今为止，udca是唯一一种获得美国食品药品监督管理局(fda)批准用于治疗原发性胆汁性肝硬化的药物。

6、瑞美吉泮(rimegepant)是第一款拥有口腔快速崩解片剂型(odt)的cgrp受体小分子拮抗剂，通过阻断cgrp受体治疗偏头痛。2020年美国fda批准biohaven公司的cgrp受体抑制剂nurtec odt口崩解片上市，用于治疗成人急性偏头痛。

7、普仑司特中间体3ahap其合成方法主要是化学合成法，可通过四步反应途径获得。该途径的第二步涉及fries重排，该重排涉及酚酯在lewis或bronsted酸的催化下重排为o-或p-酰基苯酚。然而，由于使用氯仿和二氯甲烷等有机溶剂，这一步骤具有很高的环境污染风险。此外，反应系统中使用的催化剂，如alcl3、bf3和ticl4，可能会释放有毒气体，对环境有害。

8、熊去氧胆酸udca现在通过化学或生物合成途径制备：该化学途径通过七步合成产生udca，使用胆酸(ca)或鹅去氧胆酸(cdca)作为起始底物，这条路线需要使用有毒和危险的肼、cro3和吡啶试剂，并产生大量废物，此外总产率仅为约30％。通过化学合成生产的udca在数量和质量上仍远不能满足市场需求。

9、瑞美吉泮中间体现有合成方法主要是化学法，包括以3-氨基-2-氯吡啶与1-cbz-4-哌啶酮为起始底物这条路线，需要多步反应制得，污染大，收率低，操作复杂，不符合应用工业化生产的条件。因此，亟需寻找一种绿色环保，收率高，操作简便的制备方法。

10、与化学合成相比，生物合成更环保、高效、安全，普仑司特中间体3ahap、熊去氧胆酸udca和瑞美吉泮中间体的生物合成正在逐步发展。其生物合成主要是游离酶催化合成或全细胞催化。全细胞催化或自由酶催化合成以间硝基苯乙酮3nap、7-酮石胆酸7-klca或吡啶-2,3-二胺及4-氧代哌啶酮盐酸盐为底物，通过多酶级联反应生成普仑司特中间体3ahap、熊去氧胆酸udca和瑞美吉泮中间体。

11、普仑司特中间体3ahap、熊去氧胆酸udca和瑞美吉泮中间体的生物合成依靠多酶体系催化，且催化过程需要nadph作为电子供体，催化1mol底物官能团需要消耗等摩尔的nadph辅因子，因此nadph辅因子浓度对其催化活力的影响重大。然而nadph辅因子价格高昂，实际工业应用中不允许大量添加。葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase，gdh)能氧化葡萄糖生成葡萄糖酸，同时将nad(p)+还原为nad(p)h，是氧化还原生物合成中辅酶再生体系的关键酶。cn116426578a公开了一种生物合成普伦斯特中间体的方法，利用葡萄糖脱氢酶gdh催化葡萄糖为反应途径提供所需消耗的nadph，不用向反应体系中额外加入纯净nadph，但细胞中含有的nadp数量有限，能生成的nadph也较少，无法满足还原反应的需要，一般来说出于提高反应效率考虑，仍然要在反应体系中加入额外的nadph，这会导致成本增加。nadp辅因子价格远低于nadph，而nad价格又远低于nadp。nad激酶(nadk)磷酸化nad+是nadp从头生成的唯一已知机制。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)磷酸(nadp(h))在氧化还原稳态和代谢中起着至关重要的作用，如果能够通过引入nad(h)激酶基因的过表达，调节胞内的氧化还原平衡状态，可能可以提高目标产品的产量。

12、nad激酶和nadh激酶使用atp或无机聚磷酸盐作为磷酸化供体，特异性催化nad(h)腺苷核糖部分的2’-羟基磷酸化生成nadp(h)。大肠杆菌胞内nad(h)含量远高于nadp(h)含量，nad激酶(nad(h)kinase)催化nad(h)发生磷酸化，并转变成nadp(h)，是微生物中nadp(h)合成的直接来源和关键步骤。

13、将构建的包含nad激酶nadk的辅酶自足型底盘细胞引入上述多酶体系反应，催化nad生成nadp供给多酶体系反应生成昂贵的辅因子nadph，可以有效提高催化效率，并降低生产成本：通过修饰nad激酶nadk的关键氨基酸残基，可以提高关键酶的特异性酶活，能够有效地减少细胞的使用。这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义，因此筛选高产nad激酶突变株就显得尤为重要。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中nad激酶的酶活性不高等缺陷，本发明的目的是构建一种辅酶自足型的底盘细胞，选择大肠杆菌bl21(de3)作为底盘细胞，并将通过将来源于corynebacterium glutamicum的nad激酶nad或其突变体构建于质粒载体上，将其转化入大肠杆菌bl21(de3)中，形成辅酶自足型的底盘细胞，并将其应用于多酶体系生产医药中间体普伦司特中间体3-氨基-2-羟基苯乙酮、熊去氧胆酸、和瑞美吉泮中间体。

2、本发明提供了一种源自corynebacterium glutamicum的nad激酶，氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明还提供nad激酶突变体，所述nad激酶突变体是由seq id no.1所示的氨基酸序列第110位、170位和259位进行单点突变或多点叠加突变获得。

4、seq id no.1所示氨基酸序列的nad激酶在本技术中可以被称为nad激酶的野生型酶。是来源于corynebacterium glutamicum的注释为nad激酶(cgnadk)的氨基酸序列，经本发明优化得到。所述野生型酶的核苷酸序列可以为seq id no.4所示的核苷酸序列。

5、本技术所述的nad激酶或其突变体具有nad激酶活性，即将nad转化为nadp的活性，特别地，本技术所述的nad激酶突变体具有将nad转化为nadp的改进的活性。

6、进一步，所述nad激酶突变体，优选所述突变为下列之一或两种以上：

7、(1)将seq id no.1所示的氨基酸序列第170位氨基酸残基g突变为r、k、a、h或p；

8、(2)将seq id no.1所示的氨基酸序列第259位氨基酸残基f突变为g、a或h；

9、(3)将seq id no.1所示的氨基酸序列第110位氨基酸残基g突变为w、e或r。

10、更优选的，所述nad激酶突变体为以下之一：

11、(a)将seq id no.1所示的氨基酸序列第170位氨基酸残基g突变为r，且第259位氨基酸残基f突变为a；

12、(b)将seq id no.1所示的氨基酸序列第170位氨基酸残基g突变为r，且第110位氨基酸残基g突变为w；

13、(c)将seq id no.1所示的氨基酸序列第170位氨基酸残基g突变为r，且第110位氨基酸残基g突变为e；

14、(d)将seq id no.1所示的氨基酸序列第170位氨基酸残基g突变为r，且第110位氨基酸残基g突变为r。

15、更优选所述nad激酶突变体为(a)将seq id no.1所示的氨基酸序列第170位氨基酸残基g突变为r，且第259位氨基酸残基f突变为a，氨基酸序列如seq id no.3所示。

16、由于氨基酸序列的特殊性，任何含有本发明所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用异亮氨酸替换亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用甘氨酸替换丙氨酸。

17、进一步，seq id no.1所示的氨基酸序列第170位g突变为r的氨基酸序列如seq idno.2所示。

18、seq id no.1所示的氨基酸序列第170位氨基酸残基g突变为r，且第259位氨基酸残基f突变为a的氨基酸序列如seq id no.3所示。

19、本发明还提供了所述的nad激酶或其突变体的编码基因。

20、其中，seq id no.1所示氨基酸序列对应的编码基因的核苷酸序列为seq id no.4所示。

21、由于核苷酸序列的特殊性，任何本发明所示多核苷酸的变体，只要其与前述多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

22、本发明还提供了包含nad激酶或其突变体的编码基因的重组表达载体。以及利用该重组表达载体构建的含有所述的nad激酶或其突变体的编码基因的辅酶自足型底盘细胞。所述辅酶自足型底盘细胞为大肠杆菌底盘细胞，宿主细胞通常为大肠杆菌bl21(de3)。

23、本发明还提供所述辅酶自足型底盘细胞在生物合成普仑司特中间体3ahap、熊去氧胆酸udca或瑞美吉泮中间体化合物ii中的应用。

24、所述辅酶自足型底盘细胞包含nad激酶或其突变体。

25、进一步，所述应用的方法为：将辅酶自足型底盘细胞引入多酶反应体系，将nad+转化为nadp+，葡萄糖脱氢酶gdh将nadp+还原生成辅酶nadph，辅酶nadph为生物合成医药中间体普仑司特中间体3ahap、熊去氧胆酸udca或瑞美吉泮中间体化合物ii提供电子，即提供还原能力。

26、具体地，本发明提供辅酶自足型底盘细胞在生物合成普仑司特中间体3ahap中的应用，所述应用的方法为：将辅酶自足型底盘细胞引入多酶反应体系，将nad+转化为nadp+，葡萄糖脱氢酶gdh将nadp+还原生成辅酶nadph，供给硝基还原酶偶联羟胺苯变位酶，将底物间硝基苯乙酮生物转化成普伦司特中间体3-氨基-2-羟苯乙酮。

27、所述反应的过程为：辅酶自足型底盘细胞中的nad激酶或其突变体将nad+转化为nadp+，葡萄糖脱氢酶gdh将nadp+还原生成辅酶nadph，在nadph提供电子的作用下，硝基苯还原酶nbza催化间硝基苯乙酮3nap生成3-羟基氨基苯乙酮3haap；羟胺苯变异酶haba催化3-羟基氨基苯乙酮3haap生成3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap。

28、反应式如下式所示：

29、

30、具体的，优选应用的方法如下：

31、以硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh、辅酶自足型底盘细胞中含有的nad激酶或其突变体为催化剂构成酶混合系统，以间硝基苯乙酮3nap为底物，添加葡萄糖、辅酶nad和atp，构建反应体系，合成3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap。

32、进一步，所述反应体系中，底物间硝基苯乙酮3nap的浓度为1～50g/l，葡萄糖的浓度为20～80g/l。

33、进一步，所述反应体系的溶剂为ph 6.5～8缓冲液，优选为ph 7～8、20～50mm的磷酸盐缓冲液。

34、反应温度为25～50℃，优选30～35℃。反应时间为1～5小时。

35、所述反应体系中，辅酶nad的浓度为1～15mm，atp的浓度为1～15mm。

36、所述反应结束后，反应液分离纯化，制得3-氨基-2-羟基苯乙酮3ahap纯品。

37、所述辅酶自足型底盘细胞可以以菌体的形式加入反应体系，也可以以细胞破碎后粗酶液或纯化后的纯酶的形式加入反应体系。

38、硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶的形式可以为酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶、细胞破碎物等：所述菌体的形式包括存活菌体细胞和/或死亡菌体细胞。

39、硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶为粗酶液形式时，反应体系中，硝基苯还原酶nbza粗酶液的质量浓度为2～10g/l，羟胺苯变异酶haba粗酶液的质量浓度为20～50g/l，葡萄糖脱氢酶gdh粗酶液的质量浓度为40～80g/l。

40、辅酶自足型底盘细胞破碎后得到的nad激酶或其突变体粗酶液的质量浓度为10～30g/l。

41、进一步，所述硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh、含有nad激酶或其突变体的辅酶自足型底盘细胞可按如下方法制备：分别将含有编码所述的硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh或nad激酶或其突变体的基因的重组基因工程菌种子液接入含卡那霉素或链霉素的lb培养基中，35～37℃培养至od600达到0.8，向发酵液中加入终浓度0.5～1mm的诱导剂iptg，于28～30℃诱导培养，将获得的培养物离心，收集菌体沉淀，即得所述硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh、含有nad激酶或其突变体的辅酶自足型底盘细胞。

42、所述粗酶液可按如下方法制备：将硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh或含有nad激酶或其突变体的辅酶自足型底盘细胞重悬于50mm ph8.0磷酸缓冲液中，均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到含硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh或nad激酶或其突变体的粗酶液。粗酶液后续可进一步用镍柱纯化、透析脱盐后得到硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh或nad激酶或其突变体的纯蛋白。

43、含有编码所述的硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh是将硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh的编码基因，插入重组表达载体后，转入宿主菌中转化制备得到。

44、所述含有nad激酶或其突变体的辅酶自足型底盘细胞是将nad激酶或其突变体的的编码基因，插入重组表达载体后，转入宿主菌中转化制备得到。

45、硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh可参照cn116426578a获得，编码基因在中国专利cn116426578a中公开。按照cn116426578a可获得含有编码所述的硝基苯还原酶nbza、羟胺苯变异酶haba、葡萄糖脱氢酶gdh的基因的重组基因工程菌。

46、本发明还提供含有nad激酶或其突变体的辅酶自足型底盘细胞在生物合成熊去氧胆酸udca中的应用，所述应用的方法为：将辅酶自足型底盘细胞引入多酶反应体系，将nad+转化为nadp+，葡萄糖脱氢酶gdh将nadp+还原生成辅酶nadph，供给羟基类固醇脱氢酶7b-hsdh，将底物7-酮石胆酸7-klca生物转化成产物熊去氧胆酸udca。

47、反应式如下式所示：

48、

49、具体的，优选应用的方法如下：

50、以羟基类固醇脱氢酶7b-hsdh、葡萄糖脱氢酶gdh、辅酶自足型底盘细胞中含有的nad激酶或其突变体为催化剂构成酶混合系统，以7-酮石胆酸7-klca为底物，添加葡萄糖、辅酶nad和atp，构建反应体系，合成熊去氧胆酸udca。

51、进一步，所述反应体系中，底物7-酮石胆酸7-klca的浓度为10～40g/l，葡萄糖的质量分数为2～5％。

52、进一步，所述反应体系的溶剂为ph 6.5～8缓冲液，优选为ph 7～8、50～100mm的磷酸盐缓冲液。

53、反应温度为25～50℃，优选30～35℃。反应时间为0.25～1小时。

54、所述反应体系中，辅酶nad的浓度为1～15mm，atp的浓度为1～15mm。

55、所述反应结束后，反应液分离纯化，制得熊去氧胆酸udca纯品。

56、所述催化剂包括羟基类固醇脱氢酶7b-hsdh、葡萄糖脱氢酶gdh，催化剂的形式可以为酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶、细胞破碎物等：所述菌体的形式包括存活菌体细胞和/或死亡菌体细胞。

57、所述辅酶自足型底盘细胞可以以菌体的形式加入反应体系，也可以以细胞破碎后粗酶液或纯化后的纯酶的形式加入反应体系。

58、所述催化剂优选为湿菌体或粗酶液的形式，催化剂为湿菌体的形式时，反应体系中，羟基类固醇脱氢酶7b-hsdh湿菌体的质量浓度为5～15g/l，葡萄糖脱氢酶gdh湿菌体的质量浓度为2～10g/l，辅酶自足型底盘细胞的质量浓度为5～15g/l。

59、进一步，优选羟基类固醇脱氢酶7b-hsdh湿菌体、葡萄糖脱氢酶gdh湿菌体、辅酶自足型底盘细胞的质量比为2：1：2。

60、底物7-酮石胆酸7-klca的浓度为10～40g/l，使其在反应体系中处于过饱和状态。

61、羟基类固醇脱氢酶7b-hsdh可参照专利cn 109182284 a或其他公开文献或专利获得，为野生型或突变体。将含有所述的羟基类固醇脱氢酶7b-hsdh的编码基因的重组基因工程菌进行培养，并诱导羟基类固醇脱氢酶7b-hsdh的表达，得到羟基类固醇脱氢酶7b-hsdh的湿菌体，进一步获得湿酶液，或者分离纯化得到纯蛋白。

62、本发明还提供含有nad激酶或其突变体的辅酶自足型底盘细胞在生物合成瑞美吉泮中间体中的应用，所述应用的方法为：将辅酶自足型底盘细胞引入多酶反应体系，将nad+转化为nadp+，葡萄糖脱氢酶gdh将nadp+还原生成辅酶nadph，供给亚胺还原酶ired，将底物吡啶-2,3-二胺和4-氧代哌啶酮盐酸盐还原生成瑞美吉泮中间体前体化合物ii。

63、瑞美吉泮中间体前体化合物ii与n,n'-羰基二咪唑cdi进一步反应生成化合物ii。

64、反应式如下式所示：

65、

66、在上述反应过程中，nad激酶及其突变体的引入将细胞中大量的与反应无关的nad+转化为nadp+，为该合成路线提供了足够且必要的nadp(h)，为反应提供能量，不仅克服了生物合成途径中额外加入nadph，消耗纯净nadph，生产成本昂贵的问题，而且提高了催化效率。

67、具体的，优选应用的方法如下：

68、以亚胺还原酶ired、葡萄糖脱氢酶gdh、辅酶自足型底盘细胞中含有的nad激酶或其突变体为催化剂构成酶混合系统，以吡啶-2,3-二胺和4-氧代哌啶酮盐酸盐为底物，添加葡萄糖、辅酶nad和atp，构建反应体系，进行还原反应，生成瑞美吉泮中间体前体化合物ii。

69、进一步，所述反应体系中，底物吡啶-2,3-二胺的浓度为3～20g/l，4-氧代哌啶酮盐酸盐的浓度为1～10g/l，葡萄糖的浓度为3～20g/l。

70、优选吡啶-2,3-二胺、4-氧代哌啶酮盐酸盐的摩尔比为2～10:1。

71、进一步，所述反应体系的溶剂为ph 6.5～8缓冲液，其中含有体积分数5％的dmao。优选为ph 7～8、50～100mm的磷酸盐缓冲液中含有体积分数5％的dmao。

72、反应温度为25～50℃，优选25～30℃。反应时间为10～15小时。

73、所述反应体系中，辅酶nad的浓度为1～15mm，atp的浓度为1～15mm。

74、所述反应结束后，反应液分离纯化，制得瑞美吉泮中间体前体化合物ii纯品。

75、所述催化剂包括亚胺还原酶ired、葡萄糖脱氢酶gdh，催化剂的形式可以为酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶、细胞破碎物等：所述菌体的形式包括存活菌体细胞和/或死亡菌体细胞。

76、所述辅酶自足型底盘细胞可以以菌体的形式加入反应体系，也可以以细胞破碎后粗酶液或纯化后的纯酶的形式加入反应体系。

77、所述催化剂优选为湿菌体、粗酶液的形式，催化剂为湿菌体的形式时，反应体系中，亚胺还原酶ired湿菌体的质量浓度为10～40g/l，辅酶自足型底盘细胞的质量浓度为5～15g/l。葡萄糖脱氢酶gdh以干粉形式加入，质量浓度为0.5～1g/l。

78、亚胺还原酶ired可参照专利cn116813612a获得，将含有所述的亚胺还原酶ired的编码基因的重组基因工程菌进行培养，并诱导亚胺还原酶ired的表达，得到亚胺还原酶ired的湿菌体，进一步破碎获得湿酶液，或者分离纯化得到纯蛋白。

79、本发明的有益效果在于：

80、1.本发明通过修饰nad激酶nadk的关键氨基酸残基，可以提高关键酶的特异性酶活，构建nad激酶突变体的酶活性相比野生型酶显著提高，能够有效地减少细胞的使用，进而降低成本，可应用于生物合成普仑司特中间体3ahap、熊去氧胆酸udca和瑞美吉泮中间体中的工业化生产。

81、2.本发明利用包含nad激酶nadk的辅酶自足型底盘细胞引入多酶反应体系，催化nad生成nadp供给多酶体系反应生成昂贵的辅因子nadph，为多酶反应体系催化生成普仑司特中间体3ahap、熊去氧胆酸udca和瑞美吉泮中间体提供所需消耗的nadp(h)，不用向反应体系中额外加入纯净nadph，降低了生产成本，并且提高了催化效率。相较于现有技术存在的污染大、高成本和反应速率不高的问题，本发明提供的生物合成途径绿色安全、原子经济性高，成本低廉、温和有效，催化效率高，具有较大的产业价值。