淡水鱼物种鉴定微型条码引物对及其设计方法和鉴定方法与流程

本发明属于分子生物学，尤其涉及一种淡水鱼物种鉴定微型条码引物对及其设计方法和鉴定方法。

背景技术：

1、淡水鱼，是指生活在淡水环境中的鱼类。世界上已知鱼类约有26000多种，约占脊椎动物总数的48.1％。它们绝大多数生活在海洋里，淡水鱼约有8600余种。我国现有鱼类近3千种，其中淡水鱼有1000余种。

2、淡水鱼包括了很多种类，如鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鳙鱼、鳟鱼、鲈鱼等等。淡水鱼是人类的重要食物来源之一，含有高蛋白、低脂肪、低胆固醇等营养成分。其中，鲤鱼、草鱼、鲫鱼等淡水鱼的营养价值较高，因为这些鱼类含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质等营养成分，能够帮助人体维持健康。除了食用价值，淡水鱼还在人们的生活中扮演着重要的角色。

3、淡水鱼的常规鉴别方法，是根据外形和体色、鳞片、鱼鳍、食性和生活环境进行常规的分类，但是对于一些幼苗、鱼卵及组织标本，无法采用上述常规方法分类鉴定。分子生物学是一门研究生物分子结构功能及其相互作用的学科，目前基于分子生物学的检测方法中，尚无针对于淡水鱼进行鉴定的具体方法，因此，具有更高准确性、更好的扩增效率的基于分子生物学的鉴定技术，对于淡水鱼的保护和研究具有重要的意义。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一种淡水鱼物种鉴定微型条码引物对，所述淡水鱼物种鉴定微型条码引物对包括：

2、如seq id no.1所示的上游引物，以及如seq id no.2所示的下游引物。

3、本发明还提供一种淡水鱼物种鉴定微型条码引物对的设计方法，包括：

4、获取不同品种鱼类的基因序列，确定其中保守区域后，设计得到淡水鱼物种鉴定微型条码引物对。

5、优选地，所述获取不同品种鱼类的基因序列，确定其中保守区域后，设计得到淡水鱼物种鉴定微型条码引物对，包括：

6、从不同品种鱼类标本中提取得到对应的dna；

7、对所述dna利用通用引物进行扩增测序，得到细胞色素b基因的cyt b序列；

8、根据所述cyt b序列确定其中的保守区域；

9、利用所述保守区域设计得到所述淡水鱼物种鉴定微型条码引物对。

10、优选地，所述通用引物包括：

11、如seq id no.3所示的上游引物和如seq id no.4所示的下游引物。

12、优选地，所述根据所述cyt b序列确定其中的保守区域，包括：

13、利用dnastar软件对所述cyt b序列进行多重比对，确定其中的所述保守区域。

14、优选地，所述利用所述保守区域设计得到所述淡水鱼物种鉴定微型条码引物对步骤中，使用primer premie5.0软件设计得到。

15、此外，本发明还提供一种鱼类物种的鉴定方法，包括：

16、取待测鱼类物种的组织中分离提取得到待测dna；

17、将所述待测dna作为模板，采用淡水鱼物种鉴定微型条码引物对，对所述鱼类物种样本中的采用通用引物未扩增出来的dna进行再pcr扩增，并得到测序结果；

18、对所述测序结果进行分析比对，确定所述待测鱼类物种对应的物种信息。

19、优选地，所述对所述鱼类物种样本中的采用通用引物未扩增出来的dna进行再pcr扩增，并得到测序结果，包括：

20、利用所述淡水鱼物种鉴定微型条码引物对，进行聚合酶链式反应，扩增所述鱼类物种的细胞色素b片段，得到扩增产物；

21、用琼脂糖凝胶电泳检测所述扩增产物，经pcr产物纯化后，进行测序，得到所述测序结果。

22、优选地，所述扩增产物的扩增片段长度为1109bp。

23、优选地，所述对所述测序结果进行分析比对，确定所述待测鱼类物种对应的物种信息，包括：

24、基于sanger测序技术，将得到的所述测序结果，利用dnasart软件中的seqman功能进行序列拼接，并删除拼接好的序列两端的引物序列，得到待分析序列；

25、将所述待分析序列在ncbi网站上进行blast比对，根据相似度、覆盖度和综合得分确定测鱼类物种的组织对应的种属信息。

26、本发明提供一种淡水鱼物种鉴定微型条码引物对，所述淡水鱼物种鉴定微型条码引物对包括：如seq id no.1所示的上游引物，以及如seq id no.2所示的下游引物。本发明提供一种淡水鱼物种鉴定微型条码引物对，基于淡水鱼物种鉴定微型条码引物对的分子生物学鉴定方法，操作简便，准确性高，能够鉴别鱼卵、幼苗期无法分辨的鱼类及常规实验室用的通用引物无法扩增出来的部分鱼类dna，为渔业研究及淡水鱼类产业提供技术支撑。

技术特征：

1.一种淡水鱼物种鉴定微型条码引物对，其特征在于，所述淡水鱼物种鉴定微型条码引物对包括：

2.一种淡水鱼物种鉴定微型条码引物对的设计方法，其特征在于，包括：

3.如权利要求2所述淡水鱼物种鉴定微型条码引物对的设计方法，其特征在于，所述获取不同品种鱼类的基因序列，确定其中保守区域后，设计得到淡水鱼物种鉴定微型条码引物对，包括：

4.如权利要求3所述淡水鱼物种鉴定微型条码引物对的设计方法，其特征在于，所述通用引物包括：

5.如权利要求3所述淡水鱼物种鉴定微型条码引物对的设计方法，其特征在于，所述根据所述cyt b序列确定其中的保守区域，包括：

6.如权利要求3所述淡水鱼物种鉴定微型条码引物对的设计方法，其特征在于，所述利用所述保守区域设计得到所述淡水鱼物种鉴定微型条码引物对步骤中，使用primerpremie5.0软件设计得到。

7.一种鱼类物种的鉴定方法，其特征在于，包括：

8.如权利要求7所述鱼类物种的鉴定方法，其特征在于，所述对所述鱼类物种样本中的采用通用引物未扩增出来的dna进行再pcr扩增，并得到测序结果，包括：

9.如权利要求8所述鱼类物种的鉴定方法，其特征在于，所述扩增产物的扩增片段长度为1109bp。

10.如权利要求7所述鱼类物种的鉴定方法，其特征在于，所述对所述测序结果进行分析比对，确定所述待测鱼类物种对应的物种信息，包括：

技术总结
本发明提供一种淡水鱼物种鉴定微型条码引物对及其设计方法和鉴定方法，属于分子生物学技术领域。所述淡水鱼物种鉴定微型条码引物对包括：如SEQ ID NO.1所示的上游引物，以及如SEQ ID NO.2所示的下游引物。本发明提供一种淡水鱼物种鉴定微型条码引物对，基于淡水鱼物种鉴定微型条码引物对的分子生物学鉴定方法，操作简便，准确性高，能够鉴别鱼卵、幼苗期无法分辨的鱼类及常规实验室用的通用引物无法扩增出来的部分鱼类DNA，为渔业研究及淡水鱼类产业提供技术支撑。

技术研发人员：王晓,张思瑶
受保护的技术使用者：生工生物工程（上海）股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11