一种利用微拟球藻发酵制备槐糖脂及微乳液的方法与流程

本发明涉及表面活性剂制备以及微乳液，尤其是涉及一种利用微拟球藻发酵制备槐糖脂及微乳液的方法。

背景技术：

1、微拟球藻(nannochloropsis)是一类单细胞海洋绿藻，具有较高的生长速率、光合作用效率、生物量、油脂含量，还富含多种生物活性物质，如叶黄素，虾青素，类胡萝卜素和多不饱和脂肪酸等，被认为工业生产epa很重要的原料之一。然而，目前微藻产油过程中的油脂提取技术大都以有机溶剂浸提为主，该方法虽然操作简单但是存在高毒性物质，具有蒸馏成本高、产品中残留有机溶剂等缺点。此外，微藻油中因富含不饱和脂肪酸，使其稳定性差，极易被氧化降解。

2、微乳液是由表面活性剂、油和水在一定的配比下自发聚集形成的外观为透明或半透明的、各向同性的、热力学稳定的体系。近年来，微乳液在理论和应用方面的研究进展不断突越。微乳液微粒尺寸小、增溶能力强还有界面张力小等是其突出特性。微乳液粒径在10-100nm之间，显著的纳米尺度使其液滴内核是制备纳米微粒的理想场所。

3、微乳液分为四种类型：(1)winsorⅰ型：o/w型微乳液与过量油相共存。(2)winsorⅲ型：微乳液相与过量水和过量油相三相共存。(3)winsorⅱ型：w/o型微乳液与过量油相共存。(4)winsorⅳ型：单相微乳液。微乳液的相态转变的机制是在相转变过程中体系始终处于各相同性状态。具有这种特征的相转变通常需要以winsorⅲ或winsorⅳ型微乳液为过渡状态。微乳体系中的相态变化相当复杂，这取决于表面活性剂的结构、温度及是否有何种添加剂等。微乳液体系通过外界环境的改变及各种添加剂的加入，改变其hlb值从而实现winsorⅰ→winsorⅲ→winsorⅱ型的相转变。

4、目前微乳液在食品、医药、化妆品、农业、生态等诸多范畴已被广泛应用。微乳液对两个不混溶物质的增溶能力主要是由表面活性剂的性质来决定。表面活性剂又被称为表面活性媒介，是一种含有亲水头与疏水尾基团的两亲性分子，能够在较低浓度条件下显著降低混合溶液表面张力。

5、根据原料来源及生产工艺的不同，表面活性剂主要分为两大类，即化学合成表面活性剂和生物表面活性剂。与化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂除了具有与之相似的物理化学性质外，还具有如下其他优点：环境友好、微生物可降解、无毒或低毒、不会致敏、能够被消化，提高了应用过程的安全性，可用作化妆品或者功能食品的添加剂。

6、近年来，关于生物表面活性剂的研究越来越多，生物表面活性剂将有可能逐步取代化学合成的表面活性剂，这将会为人类社会带来重要的经济及生态意义。槐糖脂是由一系列非致病性酵母在代谢过程中分泌的一种糖脂类次级代谢产物。在所有目前已知的微生物来源的生物表面活性剂中，槐糖脂具有最高的产量，并且其还具有良好的生物相容性，能够被微生物所降解，对环境友好。

技术实现思路

1、本发明提供了一种利用微拟球藻发酵制备槐糖脂及微乳液的方法。本发明通过微生物发酵产生生物表面活性剂，与水相油相构建形成稳定的、具有双亲性的微乳体系，同时利用微乳液的增溶能力同步提取产油藻类中的油脂和天然活性成分，达到简易、高效、无毒无害且稳定不饱和脂肪酸的目的。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种利用微拟球藻发酵制备槐糖脂的方法，具体步骤如下：

4、a1、将微拟球藻藻粉与缓冲液混合后加入纤维素酶和蛋白酶，进行酶解；

5、a2、将步骤a1所得微拟球藻藻粉的酶解液灭菌后与发酵培养基混合，而后经过假丝酵母发酵得到生物表面活性剂槐糖脂。

6、进一步地，步骤a2发酵后体系中除了生成的单一产物槐糖脂外，还包括微拟球藻自带的藻油，以及多糖多肽等天然产物。

7、优选的，步骤a1所述微拟球藻藻粉与缓冲液的固液比1:5-10g/ml。

8、进一步地，步骤a1中缓冲液的ph为4.0-6.0，所述缓冲液为不同ph的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。

9、优选的，步骤a1所述纤维素酶与蛋白酶的质量比为1:4-4:1，纤维素酶与蛋白酶的质量之和为藻粉质量的0.5％-2.5％。

10、优选的，步骤a1所述酶解为在40-60℃、180-200r/min的全温振荡培养箱中酶解36-48h。

11、优选的，步骤a2所述酶解液与发酵培养基的体积比为1:0.8-1.2；

12、优选的，所述发酵培养基的配方为：酵母粉：3g/l；kh2po4：1g/l；na2hpo4·12h2o：1g/l；mgso4：0.5g/l。

13、优选的，步骤a2所述假丝酵母的体积为发酵培养基的1-4％；所述发酵为在180-200r/min恒温振荡条件下培养160-180h。

14、进一步地，步骤a2所述灭菌为在115℃条件下灭菌20min。

15、进一步地，步骤a2所述假丝酵母采用熊蜂生假丝酵母candida bombicola atcc22214，购于宝赛质粒菌株资源公司。

16、本发明还提供了一种利用微拟球藻发酵制备微乳液的方法，将制备得到的槐糖脂和微拟球藻自带的藻油与水进行混合得到微乳液体系，通过添加不同含量的大豆油改变微乳液体系的油水比、或者通过改变温度、或者通过添加不同含量的nacl，使微乳液发生相转变，产生不同类型的微乳液。

17、进一步地，所述油水比指加入大豆油后，整体的油相与水相的体积比；所述整体的油相是指微拟球藻自带的藻油与大豆油之和。

18、优选的，当体系中添加少量的大豆油后会形成winsorⅱ型微乳液，即微乳相与平衡水相共存；

19、随着大豆油添加量的增加，油水体积比增大，水相体积不断减小，微乳相体积增大；

20、当平衡油相出现时，即油水比为0.57，体系由winsorⅱ型变为winsorⅲ型；

21、继续添加大豆油，水相体积不断减小，微乳相体积不断增大，直至水相完全消失，即油水比为0.93时体系由winsorⅲ型变为winsorⅰ型；

22、进一步添加大豆油后，微乳液的相态和微乳相体积均不再发生变化。

23、优选的，当体系温度为30℃时，体系保持为winsorⅰ型；

24、当温度在34-54℃范围时，体系转变为winsorⅲ型；

25、当温度超过54℃时，体系最终转变winsorⅱ型。

26、优选的，当体系中加入的nacl含量小于1.94％时，体系保持为winsorⅰ型；

27、当nacl含量达到1.94％时体系转变为winsorⅲ型，此时体系中同时出现过量的水相和油相；

28、当nacl含量大到13.24％时，体系最终转变winsorⅱ型。

29、本发明有益的技术效果在于：

30、1、本发明选择微拟球藻作为产油藻类生产油脂，并与假丝酵母混合发酵。微拟球藻的细胞壁可以被纤维素酶分解为葡萄糖和多肽等附加产物，作为假丝酵母培养发酵的底物，为假丝酵母生产槐糖脂提供原料。本发明通过纤维素酶和蛋白酶酶解破壁可以提高微拟球藻的破壁效果，并且绿色安全无污染，同时可产生葡萄糖和多肽，增加了微拟球藻的附加价值。

31、2、本发明在微拟球藻和假丝酵母联合发酵过程中，产生的表面活性剂和水及油形成的微乳液既防止了微拟球藻藻油中丰富的不饱和脂肪酸的氧化变质，又提高了脂溶性、水溶性活性成分的溶解性，得到了高利用价值的微乳液。

32、槐糖脂与水相、油相生成的微乳体系进一步对微拟球藻的叶黄素，虾青素，类胡萝卜素和多不饱和脂肪酸等生物活性物质进行提取、溶解并包裹，提高不饱和脂肪酸的稳定性。

33、3、本发明以微拟球藻酶解液作为微生物发酵底物生产生物表面活性剂槐糖脂，既为微生物发酵提供原料，达到了对微拟球藻的高值化利用，又节约了昂贵的碳源成本，提高微拟球藻的油脂以及其他天然成分的提取率，最终形成的微乳液富含不饱和脂肪酸和多种天然活性成分，有效防止了不饱和脂肪酸的氧化变质。

34、4、本发明将产油微藻和微生物相互协同，并以一体化的方式制备微乳液，其微乳液能很好的稳定不饱和脂肪酸且包裹了多种天然活性成分，同时通过改变通过油水比、温度和盐度的改变，实现微乳液的相转变，产生不同类型的微乳液(winsorⅱ(w/o型)和winsorⅰ(o/w型))，扩大了微乳液的应用范围，成为食品、化妆品等领域优异的使用原料。本发明通过盐度扫描法、温度扫描法和油水比扫描法监测微乳液的相转变，从而扩大该微乳液在日化用品行业的应用。

35、5、总的来说，本发明筛选出微拟球藻酶解破壁的最优条件，利用纤维素酶和中性蛋白酶提高破壁效果并生产葡萄糖和多肽。首次利用已破壁的微拟球藻(含细胞碎片和单细胞油)作为假丝酵母发酵的培养基底物用以生产槐糖脂生物表面活性剂。首次采用微拟球藻与假丝酵母联合发酵产生物表面活性剂并产生微乳液用以提取微拟球藻中的藻油和生物活性物质。通过改变盐度、油水比、温度实现发酵微乳液的相转变，获得不同类型(w/o和o/w型)的微乳液。